3.結果和討論

3.1.分層

為了了解空氣/水表面乳清蛋白的存在和數量如何影響HFBII的表面流變性，第一步是觀(guān)察純體系和混合體系的鋪展層。觀(guān)察擴散層的主要優(yōu)點(diǎn)是表面成分已知，假設幾乎所有應用于界面的蛋白質(zhì)都會(huì )擴散并留在界面上。圖1顯示了純HFBII和純乳清蛋白及其混合物的表面壓力等溫線(xiàn)。正如之前的研究[8,24]所知，與乳清蛋白相比，HFBII使表面壓力急劇上升，其行為更像剛性顆粒，而乳清蛋白則表現出更柔軟、更像聚合物的行為。據推測，由于乳清蛋白在界面處的構象變化，即展開(kāi)，以及其大分子量，表面壓力在較低的表面負荷下升高。然而，上升幅度遠小于HFBII，乳清蛋白達到的最大表面壓力也較低。關(guān)于混合層的等溫線(xiàn)，可以觀(guān)察到，對于低水平，曲線(xiàn)移動(dòng)到稍大的表面積，曲線(xiàn)的形狀仍然讓人想起純WPI曲線(xiàn)。當混合物中HFBII的比例上升到1:1或更高時(shí)，曲線(xiàn)的陡度增加，表面壓力開(kāi)始在較小的表面積處形成。另一個(gè)需要提及的重要事項是，對于純HFBII，由于HFBII層的2D相變和凝固[11]，應注意22 mN/m以上的表面壓力值，從而形成具有顯著(zhù)屈服應力的強彈性表面，可維持局部吸附和變形梯度[25]。因此，高于該值時(shí)，表面壓力傳感器附近的局部表面變形可能不同于全球平均變形。宏觀(guān)上，這也表現在表面上形成褶皺，這也表明了不均勻的變形和應力分布，如下所述。

圖1。純蛋白質(zhì)系統WPI（右）和HFBII（左）以及口糧WPI:HFBII為10:1、3:1、1:1、1:3和1:10的混合系統的表面壓力等溫線(xiàn)。

值得注意的是，對于純HFBII，П–A等溫線(xiàn)在連續的壓縮膨脹循環(huán)中不會(huì )發(fā)生變化，這再次表明HFBII不可撤銷(xiāo)地附著(zhù)在界面上，幾乎沒(méi)有任何構象變化。對于純WPI和1:1混合物，П–A等溫線(xiàn)略微向較小區域移動(dòng)，這表明由于WPI分子的構象變化、多層形成或如前所述，由于WPI的解吸，表面重排的可能性較小。

為了便于比較，從圖1的數據中，使用表面壓力第一次上升的斜率（由第一次壓縮產(chǎn)生）和公式E=（?2）提取了表觀(guān)膨脹模量（E）??1）/ln（A1/A2）。曲線(xiàn)的斜率總是在表面壓力在15到25 mN/m之間波動(dòng)的表面積范圍內確定的。圖2顯示了表觀(guān)模量作為混合比的函數，表示為HFBII分數fHFBII=cHFBII/（cHFBII+cWPI）。

圖2。表觀(guān)模量作為擴散層HFBII分數的函數，以及槽屏障之間界面上褶皺斑塊的圖示。右邊是純HFBII層的一個(gè)褶皺斑的顯微鏡照片。

從圖2中可以看出，HFBII分數高達0.5的混合層，WPI的存在似乎主導了П15至25 mN/m之間界面處的表面流變行為。僅觀(guān)察到表面模量略有增加，此外，觀(guān)察到界面完全光滑。從HFBII分數為0.75開(kāi)始，行為開(kāi)始顯示HFBII層的特性?；诒碛^(guān)模量，從WPI主導行為到HFBII主導行為的轉變對應于褶皺斑塊的視覺(jué)觀(guān)察，這對于壓力高于22 mN/m的純HFBII層來(lái)說(shuō)是典型的。最后，在純HFBII系統中，斑塊相互連接，并觀(guān)察到最高模量，表明已知的HFBII行為。從這些觀(guān)察結果可以清楚地看出，在較低的HFBII/WPI比率下，富HFBII的疇的表面分離，包圍著(zhù)富WPI的2D相，隨著(zhù)HFBII比率的增加，這些疇的大小增加，它們變得相互連接，因此在fHFBII=0.6左右時(shí)，表面變得以HFBII為主。

3.2.吸附層

發(fā)泡系統的下一步是觀(guān)察吸附層。與擴散層相反，表面成分未知；只有蛋白質(zhì)的體積比是已知的。此外，表面成分可能會(huì )隨時(shí)間而變化，因為除了界面上WPI可能發(fā)生的構象變化外，表面和本體之間的材料連續交換是可能的。

圖3顯示了表面壓力隨時(shí)間的變化。第一次～100 s后，清潔表面后，屏障仍在膨脹（程序說(shuō)明見(jiàn)第2.2.2節），而在實(shí)驗開(kāi)始后100 s至1000 s之間，表面積保持恒定，以允許吸附層形成并平衡。從1000秒開(kāi)始，界面被壓縮，因此表面壓力增加。與在擴展層中觀(guān)察到的情況類(lèi)似（在一個(gè)周期內，時(shí)間和面積呈線(xiàn)性關(guān)系），純HFBII的表面壓力增加斜率遠高于純WPI。大約2500秒后，表面再次膨脹，導致表面壓力降低。同樣在混合系統中，表面壓力在1000 s后趨于平穩。應注意1000 s后平衡表面壓力的絕對值，因為在22 mN/m以上以HFBII為主的層的情況下，界面變得有彈性，在0秒清潔表面后，可能會(huì )出現皺紋，并且針重新進(jìn)入表面。在清潔界面和針浸入界面之間，可能已經(jīng)吸附了一些蛋白質(zhì)（當使用吸附層時(shí)，與使用鋪展層相比，校準表面張力并不容易，因為吸附實(shí)驗并不像使用鋪展層那樣從清潔的純水界面開(kāi)始）然而，吸附過(guò)程中的曲線(xiàn)形狀，壓縮和膨脹提供了有關(guān)吸附層功能的重要信息。從1000秒開(kāi)始，第一次壓縮開(kāi)始，在大約2500秒時(shí)，接口再次擴展。

現在，讓我們討論擴散和吸附HFBII和WPI層之間的差異（見(jiàn)圖1和圖3）。擴散層和吸附層的吸附等溫線(xiàn)形狀大致相似。主要區別在于記錄開(kāi)始時(shí)表面壓力較高。對于鋪展層，選擇施加蛋白質(zhì)的量，使施加后的表面壓力在第一次壓縮前上升至約1 mN/m。在吸附的情況下，界面上蛋白質(zhì)的數量，以及表面壓力取決于吸附速率。吸附速率取決于蛋白質(zhì)在本體中的濃度及其表面活性。該濃度選擇得相當高（0.1 mg/ml），因此吸附在界面上的蛋白質(zhì)量不會(huì )顯著(zhù)影響整體蛋白質(zhì)濃度。

同樣在視覺(jué)觀(guān)察中（見(jiàn)圖5），觀(guān)察到了與傳播系統的相似性。照片是從朗繆爾槽中的吸附層和壓縮層拍攝的。觀(guān)察到，在HFBII分數為0.33及以上的吸附層中，會(huì )形成典型的HFBII褶皺，這與擴散層不同，在擴散層中，從fHFBII分數為0.75起觀(guān)察到褶皺（重要的是要記住，第一個(gè)是體積中的蛋白質(zhì)比率，第二個(gè)是界面處的蛋白質(zhì)比率）。另一個(gè)區別是，在吸附系統中，皺紋更多地出現在屏障處的彎月面上，而在擴散系統中，皺紋出現在均勻分布在槽區的斑塊中（見(jiàn)圖2）。

圖5。在液體中不同疏水組分的朗繆爾槽上，HFBII/WPI混合溶液的吸附層照片：a:fHFBII=1，B:fHFBII=0.67，C:fHFBII=0.5，D:fHFBII=0.33。

圖4給出了純系統和一個(gè)混合系統在幾個(gè)壓縮/膨脹循環(huán)期間的表面壓力等溫線(xiàn)。我們注意到，在該圖中，HFBII和WPI的表面積按擴展系統曲線(xiàn)中彎曲點(diǎn)的出現比例縮放（圖1）。已知這一點(diǎn)反映了表面中明顯的緊密堆積轉變[8]。第一次壓縮導致的表面壓力的初始上升可以轉化為表觀(guān)膨脹模量，類(lèi)似于對鋪展層所做的，盡管蛋白質(zhì)的總量可能會(huì )因吸附而變化，因此在這種情況下，吸附和表面積是不可互換的。由于表面壓力的絕對值是未知的，所以決定考慮在壓縮時(shí)表面壓力的第一個(gè)10 Mn/m的上升來(lái)計算模量。圖7（上圖）給出了表觀(guān)模量與本體溶液中HFBII分數的函數關(guān)系。從圖中可以看出，從HFBII分數為0.33或以上的情況來(lái)看，吸附層以HFBII為主。這與皺紋的出現是一致的（圖5）。

圖4。?/A-純HFBII、純WPI及其1:10混合物的吸附系統的等溫線(xiàn)，所有這些系統的總蛋白質(zhì)濃度均為0.1 mg/ml。等溫線(xiàn)包括第一個(gè)壓縮/膨脹循環(huán)和5個(gè)滯后環(huán)。將HFBII和WPI的表面積縮放至攤鋪系統曲線(xiàn)中彎曲點(diǎn)的出現，對應于表面的明顯緊密堆積過(guò)渡（圖1）。

有趣的是，將吸附層（圖7，頂部）的過(guò)渡點(diǎn)與HFBII占主導地位的行為進(jìn)行比較，前者大致介于HFBII（整體）0.2和0.3（圖6）之間，后者大致位于0.6（表面）的擴散層（圖2）之間。假設這種情況發(fā)生在大致相同的表面成分上，這將表明0.2 HFBII:WPI本體成分對應于界面處的0.6 HFBII:WPI，毫不奇怪地證實(shí)HFBII比WPI更具表面活性。當然，應該注意的是，吸附實(shí)驗中存在的HFBII的絕對量高于擴散實(shí)驗中的HFBII絕對量，并且由于來(lái)自塊體的額外蛋白質(zhì)吸附，界面處的比率可能會(huì )隨著(zhù)壓縮/膨脹循環(huán)而改變，如下文所述，可能會(huì )形成多層。

圖6。表觀(guān)模量E是WPI和HFBII混合溶液中吸附層HFBII分數的函數。

當仔細觀(guān)察混合吸附層（圖4）的表面壓力等溫線(xiàn)時(shí)，很明顯，?/a曲線(xiàn)隨著(zhù)每個(gè)壓縮循環(huán)向左移動(dòng)（面積較?。?，而純蛋白質(zhì)的曲線(xiàn)在第一次膨脹/壓縮循環(huán)后幾乎沒(méi)有變化，在第一次膨脹/壓縮循環(huán)中，各層或多或少處于平衡狀態(tài)。純體系的行為可以用這樣一個(gè)事實(shí)來(lái)解釋?zhuān)旱鞍踪|(zhì)實(shí)際上是不可逆地吸附在界面上的（從鋪展層的實(shí)驗中也可以清楚地看到）。在膨脹的前幾個(gè)循環(huán)中，更多的蛋白質(zhì)可以吸附在自由表面，直到在最大膨脹點(diǎn)達到“平衡”。當系統被壓縮時(shí)，由于蛋白質(zhì)不能解吸，各層被簡(jiǎn)單地壓縮（對于WPI而言，部分表面展開(kāi)），并且可能形成一種結構，WPII不能完全從界面解吸，而是垂直重新排列，并在富含HFBII的層下方形成第二層。這一假設用圖7中的圖表和下面的討論加以說(shuō)明。在接下來(lái)的膨脹周期中，一些新的蛋白質(zhì)可以繼續吸附，但由于現在表面濃度已經(jīng)高于平衡體積濃度，沒(méi)有新的蛋白質(zhì)會(huì )被吸附。此外，表面下第二層和靠近開(kāi)放區域的WPI可以“翻轉”并填充膨脹間隙，比任何新的蛋白質(zhì)從塊體中吸附的速度都快。這樣，就達到了一種穩定狀態(tài)。

圖7。重復壓縮和膨脹后HFBII:WPI混合層結構形成示意圖。請注意，乳清蛋白的主要成分BLG僅在此處顯示。壓縮：BLG的一部分從表面排出，形成一個(gè)子層。膨脹：BLG的一部分停留在亞表層，而另一部分可能重新吸附到主層。頂面存在HFBII的凈濃度。

吸附混合系統的行為非常有趣，值得進(jìn)一步討論。?/A等溫線(xiàn)向左移動(dòng)的事實(shí)表明，在逐漸膨脹和壓縮后，該層變得越來(lái)越緊密，接近純HFBII的表面覆蓋。這似乎得到了以下事實(shí)的支持：壓縮后的坡度增加，并且越來(lái)越接近HFBII的坡度，這再次表明層行為逐漸由HFBII主導。對此幾乎沒(méi)有可能的解釋?zhuān)海╥）WPI在界面上的構象變化（HFBII更為剛性），這在純體系中是不存在的，但當兩種蛋白質(zhì)混合時(shí)會(huì )以某種方式出現。然而，這是不可能的，否則我們也會(huì )在擴散層中看到它的跡象；（ii）界面處的拓撲重排，最初界面是2D WPI連續的，WPI占主導地位，有一些分散的HFBII 2D域。這些域將在壓縮和擴展后逐漸互連，并形成HFBII連續網(wǎng)絡(luò )（在2D中，雙連續階段在拓撲上是不可能的）。如果這種情況再次發(fā)生，我們希望在擴散層中看到類(lèi)似的趨勢，但事實(shí)并非如此（或在非常有限的程度上）；（iii）由于WPI在界面上的吸附/解吸，界面中蛋白質(zhì)的組成發(fā)生變化，這同樣不太可能，因為兩種蛋白質(zhì)的吸附能都很高，最后（iv）在界面上形成多層結構，其中頂層富含HFBII并占主導地位，而底層富含WPI并吸附到頂層。后者可能是因為即使HFBII分子的親水部分仍然含有大量疏水氨基酸，因此也是相對疏水的，并且由于HFBII和WPI下面的靜電斥力預計非常低，因為HFBII表面層的等電點(diǎn)接近中性，這是這些系統中的相關(guān)pH值[10]。如果為真，這將給出系統的中間配置狀態(tài)，介于WPI在界面處完全吸附和完全解吸之間，具有非常高的能量差。我們還看到混合鋪展層（見(jiàn)圖1）情況下的這種行為相似，但這與體相中沒(méi)有WPI的情況不太明顯。

3.3.泡沫實(shí)驗環(huán)境和壓力循環(huán)

在前幾段中，我們考慮了HFBII和WPI在空氣/水界面的擴散和吸附層。在本節中，我們試圖將蛋白質(zhì)在界面上的行為與泡沫的形成和穩定性聯(lián)系起來(lái)。在這里，當我們根據初始氣泡尺寸來(lái)描述泡沫性時(shí)，應該注意，初始氣泡尺寸取決于泡沫性和泡沫穩定性（形成后立即），因為在測量初始氣泡尺寸之前，泡沫與0.5%黃原膠溶液混合。黃原膠為系統提供了微弱的表觀(guān)屈服應力，足以阻止奶油化和氣泡再發(fā)酵，因此我們只能研究隨后的粗化過(guò)程[8]。

圖8給出了以與圖3相同的HFBII:WPI比率制備的兩種泡沫的初始氣泡尺寸。最重要的觀(guān)察結果是，少量HFBII（來(lái)自fHFBII 0.03）在很大程度上影響泡沫的初始氣泡尺寸。此外，似乎從WPI主導向HFBII主導的行為轉變發(fā)生在fHFBII～=0.2，對應于朗繆爾槽中吸附層中觀(guān)察到的轉變（圖6）。

圖3。吸附0.1 mg/ml HFBII和WPI期間的表面壓力與時(shí)間的函數關(guān)系；包括第一次壓縮/膨脹循環(huán)（左）和壓縮和膨脹期間吸附的HFBII和WPI層的表面壓力等溫線(xiàn)。

圖8。根據濁度掃描測量評估的環(huán)境充氣泡沫和壓力循環(huán)泡沫的初始氣泡尺寸（用0.5%黃原膠稀釋后）。

這表明，與鋪展層相比，泡沫中的成分功能性更好地對應于吸附層，這是有道理的，因為在泡沫形成期間，蛋白質(zhì)層是通過(guò)吸附而不是在氣泡表面鋪展形成的，當氣泡通過(guò)攪拌器攪拌附近的高剪切區時(shí)，蛋白質(zhì)層也會(huì )膨脹和收縮。最后的觀(guān)察結果是，當空氣/水界面以HFBII為主時(shí)，壓力循環(huán)樣品的初始氣泡尺寸似乎比未進(jìn)行壓力循環(huán)的樣品小。

氣泡尺寸隨時(shí)間的相對增加如圖9所示，表示為d2（t）/d2（0）?？紤]到環(huán)境充氣樣品的泡沫穩定性，對于純HFBII系統，在本實(shí)驗期間未發(fā)現平均氣泡尺寸的顯著(zhù)變化，表明幾乎不可能發(fā)生任何歧化。在純WPI的情況下，可以發(fā)現氣泡尺寸急劇增加，表明對歧化的穩定性較差。在混合情況下，隨著(zhù)fHFBII的增加，我們可以看到氣泡尺寸穩定性增加的趨勢。我們可以粗略地說(shuō)，當fHFBII<0.2時(shí)，氣泡大小的初始演化在很大程度上取決于WPI。然而，當fHFBII>0.2時(shí)，HFBII的存在控制泡沫穩定性。這與在朗繆爾槽中觀(guān)察到的初始氣泡大小和吸附層的趨勢非常一致。

圖9。使用TurbirScan根據氣泡尺寸演變評估泡沫穩定性

對于0.03<fHFBII<0.2的泡沫中氣泡尺寸的增加，觀(guān)察到在初始粗化數小時(shí)后，曲線(xiàn)趨于平穩。在粗化過(guò)程中，小氣泡的收縮和總氣泡中較大氣泡的增長(cháng)導致泡沫總表面積的凈減少。上述結果表明，氣泡穩定性隨著(zhù)表面積的逐漸減小而增加，這與朗繆爾槽上吸附系統在大變形壓縮/膨脹循環(huán)中觀(guān)察到的行為一致。

4.結論

在朗繆爾槽上研究了空氣/水界面上分散和吸附的WPI/HFBII層，其性質(zhì)與泡沫的形成和穩定性有關(guān)。在擴散和吸附系統中，觀(guān)察到模量隨著(zhù)表面或亞相中HFBII的分數逐漸增加，我們可以確定WPI主導行為和HFBII主導行為的區域。通過(guò)對混合表層皺紋的目視觀(guān)察，進(jìn)一步證實(shí)了HFBII的優(yōu)勢。

當比較擴散和吸附系統時(shí)，發(fā)現需要更高的HFBII分數才能在擴散層中獲得HFBII主導行為，而不是吸附層（fHFBII分別為0.6和0.2）。此外，我們的結果表明，與擴散層相比，在連續的大規模壓縮/膨脹循環(huán)中，吸附層中蛋白質(zhì)的組成會(huì )發(fā)生變化。我們解釋了擴散層和吸附層之間的差異，可能在界面處形成雙層/多層，頂層較硬，主要由HFBII控制，底層較軟，主要由WPI控制。這兩層的作用類(lèi)似于平行連接的粘彈性膜，整體表面性質(zhì)由較強的富HFBII層控制。從真實(shí)泡沫的初始氣泡尺寸及其抗粗化的長(cháng)期穩定性數據來(lái)看，泡沫行為與吸附層中測量的表面膨脹特性密切相關(guān)。最后，我們觀(guān)察到，在HFBII和WPI的混合體系中，粗化過(guò)程隨著(zhù)時(shí)間的推移逐漸趨于平穩，這進(jìn)一步支持了我們關(guān)于氣泡表面多層形成的假設。

致謝

作者衷心感謝Jeoffrey Jansen先生對Turbuscan實(shí)驗的幫助。荷蘭聯(lián)合利華研發(fā)部的魯本·阿諾多夫博士和英國科爾沃思聯(lián)合利華研發(fā)部的安德魯·考克斯博士因激發(fā)討論而受到認可。這項工作由荷蘭聯(lián)合利華研發(fā)中心弗拉丁根提供資金和執行。