材料和方法

所有溶液均使用無(wú)熱原Milli-Q水（微孔）制備。 從西格瑪化學(xué)公司購買(mǎi)了HPLC級三苯醚、聚氧乙烯基-9-月桂基醚、C12（EO）9、二吡啶基磷脂酸（DMPA）、2-氨基-2-甲基丙烷-1-醇（AMPOL）、對硝基苯磷酸酯（PNPP）和異硫氰酸熒光素。從默克公司獲得氯仿、甲醇和氯化鎂。 所有其他試劑均具有最高的市售純度。

堿性磷酸酶的制備。 該酶由富含堿性磷酸酶的大鼠骨板膜制備。37個(gè)膜結合堿性磷酸酶（0.2 mg/mL）樣品在25°C條件下，在恒定攪拌下，用1%（最終濃度）C12-（EO）9（polidocanol）溶解2 h。 在30000g離心2h后，將溶解洗滌劑形式的堿性磷酸酶（DSAP）濃縮在YM-5 Amicon過(guò)濾器上，并用5mmol透析過(guò)夜 ● L-1 Tris“HCl緩沖液，pH值7.5，含2 mmol ● L-1 MgCl2，150 mmol ● L-1氯化鈉和0.01%（v/v）聚二十二烷醇。 最后，在Sephacryl S-300柱（130×1.7cm）上純化DSAP，在相同的緩沖液中平衡和洗脫。 在非變性條件下純化酶的聚環(huán)丙酰胺凝膠電泳38顯示出與酶活性一致的單一蛋白帶。 在均相溶液中PNPP水解時(shí)測得的純化DSAP的比活性為1482.0 nmol的PNP-“min-1”mg-1（PNP-）對硝基苯酚（PNPP的水解產(chǎn)物），在先前報告的范圍內。39在0.01%（v/v）的存在下，將酶保持在碎冰中 polidocanol的有效期為1個(gè)月，沒(méi)有明顯的活性損失。

朗繆爾單分子膜和表面壓力面積等溫線(xiàn)。 純DMPA和DMPA/DSAP混合單分子膜的制備方法是將其溶液（20μL用于1×10-3 mol L-1 DMPA，100μL用于7.3μg/mL DSAP）分散在槽（芬蘭Kibron，體積為70 mL，總面積為115 cm2）中包含的亞相上，并由2 mmol組成 ● 50 mmol中的L-1 MgCl2 ● L-1氨酚緩沖液，pH 9.4（DSAP催化活性的最佳值），導致初始零表面壓力。 DMPA溶液在氯仿/甲醇混合物（3:1）中制備，如別處所述。40對于脂質(zhì)/蛋白質(zhì)混合單層，DSAP溶液在5 mmol中制備 ● 含有2 mmol的pH值為7.5的L-1 Tris“HCl緩沖液 ● DMPA單分子膜形成后，在界面擴散L-1MgCl2和0.01%polidocanol（DSAP儲存的最佳條件），在混合單分子膜中提供6.12 ng/cm2的初始酶表面密度（以1:3500的摩爾比例，蛋白質(zhì)/脂質(zhì)）。 大約10-15分鐘用于表面壓力穩定、溶劑蒸發(fā)和單層組分的橫向擴散。 然后通過(guò)使用側向屏障壓縮單層（純或混合），直至達到塌陷。 為了比較純脂質(zhì)和混合蛋白質(zhì)/脂質(zhì)單層的曲線(xiàn)，將兩種等溫線(xiàn)記錄為平均脂質(zhì)分子面積的函數。 單層實(shí)驗在37±1°C下進(jìn)行。

為了測試非離子表面活性劑的影響，記錄了在2.5×10-7mol/L聚對苯二甲酸乙二醇酯水溶液上DMPA單層的等溫線(xiàn)。 這實(shí)際上與在純水上得到的DMPA一致。

酶活性。 在形成DSAP/DMPA混合單層后，界面被壓縮，直到達到所需的表面壓力。 將濃縮PNPP溶液注入亞相，以達到1 mmol的最終濃度 ● L-1（酶飽和條件）。 在37°C下，通過(guò)測量反應產(chǎn)物對硝基苯酚離子（E 410nm，pH9.4）17600 mol“L-1”cm-1的吸光度，在亞階段監測底物水解。 這些測量是通過(guò)二極管陣列分光光度計（Spectropete，世界精密儀器公司，美國）的采樣微升尖端完成的。 該測量裝置由一個(gè)位于微移液管頂端的特殊微室組成，該微室配有一根發(fā)射收集光纖和一個(gè)微插入器。 在整個(gè)實(shí)驗過(guò)程中，在連續攪拌下，微細胞尖端直接浸入單層亞相。 在適當的時(shí)間間隔內，自動(dòng)提取約2μL亞相的等份，并通過(guò)計算機記錄整個(gè)吸收光譜進(jìn)行分析，然后將提取體積返回亞相，保持槽體積恒定。

在沒(méi)有酶或單層的情況下進(jìn)行對照實(shí)驗，以確保估計的酶活性完全是由于界面上存在的酶。簡(jiǎn)而言之，實(shí)驗中使用的槽有三個(gè)隔間，通過(guò)狹縫從一側連接到另一側（0.5 mm寬，2 mm長(cháng)，0.2 mm深）在接口水平面。因此，有兩個(gè)“橫向”隔室和一個(gè)“中央”隔室。隔室的墻壁防止“通信”在亞相之間，我們可以認為它們是孤立的。DMPA和酶在槽上擴散，并在一定時(shí)間內（20分鐘）擴散。允許溶劑蒸發(fā)和平衡。之后，使用兩個(gè)橫向屏障壓縮混合單層，將其限制在中央隔室的界面上。然后將底物PNPP注入三個(gè)隔室的亞相，并通過(guò)監測ab測定所有隔室中的酶活性PNPP水解產(chǎn)物的吸附性。對照實(shí)驗也在均相介質(zhì)中進(jìn)行，使用1mmol●L-1 PNPP和2 mmol●50 mmol中的L-1 MgCl2●L-1 AMPOL緩沖液，pH值9.4（酶活性評估和底物飽和的最佳條件）。Langmuir單分子膜的酶活性以溶液中測定的百分比表示（約1480 nmol PNP-“min-1”mg-1酶）。

在玉蘭油玉蘭油玉蘭油（Paulo）、巴西RieBiRa Pro to Pror大學(xué)的實(shí)驗室中，用熒光顯微鏡（OLYBUS B-MAX）獲得了混合單分子層的熒光顯微照片。配備高靈敏度SIT攝像機（濱松C-24）.使用透析共軛技術(shù)41用異硫氰酸熒光素標記的DSAP作為熒光探針?？紤]到標記可使蛋白質(zhì)變性，僅1 mol%的標記蛋白質(zhì)與天然DSAP混合，這足以在空氣/水界面識別富含蛋白質(zhì)的結構域。

分子表面包裝對于磷脂單分子層膜中的錨定蛋白中酶活性的調制作用的影響——摘要、介紹

分子表面包裝對于磷脂單分子層膜中的錨定蛋白中酶活性的調制作用的影響——材料和方法

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