3討論

近年來(lái)，針對分枝桿菌的研究以宿主導向治療（HDT）為核心的免疫治療策略為主。HDT不僅可以對耐藥菌和敏感菌治療有效，而且避免了細菌耐藥性的產(chǎn)生，可以縮短抗生素治療周期。COSTA等建議將HO-1作為HDT治療結核病的潛在靶點(diǎn)。說(shuō)明HO-1具有潛在的治療價(jià)值。本研究結果發(fā)現，HO-1過(guò)表達能夠有效抑制M.abs誘導的自噬相關(guān)蛋白ATG5、LC3Ⅱ表達，p62表達增加，對溶酶體熒光值影響較小。抑制HO-1酶活性能有效增強ATG5、LC3Ⅱ表達，p62表達減少，溶酶體熒光值增加。說(shuō)明抑制HO-1能有效增強自噬流的發(fā)生，有利于清除細胞內M.abs。

HO-1表達變化對胞內菌生長(cháng)具有重要影響。本研究發(fā)現M.abs在感染過(guò)程中HO-1蛋白表達先增加，隨著(zhù)感染復數增加或感染時(shí)間延長(cháng)，HO-1蛋白表達有下降趨勢。一方面，M.abs感染早期，HO-1表達增加有助于M.abs胞內增殖，可能與HO-1催化產(chǎn)物亞鐵離子為細菌生長(cháng)提供了營(yíng)養物質(zhì)有關(guān)，或者可能與HO-1表達增加抑制了細胞凋亡，為細菌胞內存活提供有利環(huán)境有關(guān)。此外，HO-1過(guò)表達產(chǎn)生大量游離亞鐵離子可引起鐵死亡，導致分枝桿菌在細胞中傳播。由此可見(jiàn)，HO-1表達增加不利于宿主對胞內菌的清除。另一方面，隨著(zhù)M.abs感染時(shí)間的延長(cháng)，HO-1蛋白表達有降低趨勢，可能與M.abs感染后期，宿主抑制HO-1表達，增強自身自噬活性，清除胞內M.abs及減輕細胞炎癥反應有關(guān)。

自噬增強對病原體胞內清除具有重要的作用。自噬參與固有免疫反應和適應性免疫反應，是機體清除自身有害的成分，維持自身穩態(tài)的一種調節方式。近年來(lái)，有文獻報道自噬增強可以有效控制胞內病原體，并且已有自噬選擇性治療藥物相關(guān)報道。一般情況下，p62被認為是自噬流的標志物，其通過(guò)與LC3相互作用錨定于吞噬體上，并在自噬活化過(guò)程中通過(guò)自噬溶酶體途徑不斷被降解。因此，p62表達量反映了自噬活化強弱。自噬相關(guān)蛋白Atg5是LC3Ⅰ向LC3Ⅱ蛋白轉換以及使LC3Ⅱ蛋白錨定于自噬體的關(guān)鍵蛋白。Atg5減少說(shuō)明其轉化作用受抑制，從而使LC3Ⅱ表達減少，自噬體形成減少，p62體內聚集，抑制自噬。這說(shuō)明Atg5是控制自噬強弱的關(guān)鍵蛋白，它可影響整個(gè)自噬功能的結局。本研究結果揭示，M.abs誘導自噬相關(guān)蛋白ATG5、LC3Ⅱ增加，說(shuō)明M.abs可誘導自噬小體形成，然而p62并沒(méi)有減少，反而增多，說(shuō)明M.abs抑制自噬溶酶體降解，阻斷了M.abs胞內清除，與KIM等的研究結果相似。此外，自噬流標志物p62和HO-1之間有密切的聯(lián)系。KATSURAGI等研究發(fā)現p62磷酸化可增強p62與Keap1之間的親和力，促使Nrf2與Keap1復合物分離并轉入細胞核，導致Nrf2相關(guān)性抗氧化蛋白HO-1的表達增加，p62與Keap1隨后通過(guò)自噬途徑被降解。本研究發(fā)現HO-1誘導劑CoPP預處理后，HO-1和p62表達顯著(zhù)升高，HO-1表達增加可能與p62與Nrf2競爭性結合Keap1，促使Nrf2入核誘導HO-1表達有關(guān)，但本研究沒(méi)有發(fā)現p62表達減少現象，可能與自噬被抑制有關(guān)。此外，本研究通過(guò)采用HO-1誘導劑CoPP和酶抑制劑SnPP預處理發(fā)現，HO-1有效調控Atg5表達，對p62和LC3Ⅱ表達結果與KIM等采用Atg5 siRNA干擾結果一致。因此，本研究結果說(shuō)明HO-1至少可以通過(guò)調節Atg5進(jìn)行自噬小體調控。進(jìn)一步用LysoTracker Red染色發(fā)現SnPP抑制HO-1能顯著(zhù)增加細胞溶酶體酸性區室熒光。采用早期自噬抑制劑3-MA和晚期自噬抑制劑BafA1均顯著(zhù)減少溶酶體紅色熒光，說(shuō)明抑制HO-1能動(dòng)員更多溶酶體參與自噬活化。

值得一提的是，本研究胞內菌落計數實(shí)驗結果發(fā)現，CoPP預處理組與單獨M.abs組差異無(wú)統計學(xué)意義。SnPP預處理細胞3 h后加入M.abs共孵育24 h，菌落計數沒(méi)有明顯減少。然而SnPP預處理細胞12 h后加入M.abs共孵育48 h，顯著(zhù)抑制胞內細菌生長(cháng)和細胞因子TNF-α表達。TNF-α表達結果與SCHARN等研究結果相似，可能與自噬增強清除病原菌導致炎癥減輕有關(guān)。一般而言，炎癥、自噬和細菌胞內存活三者之間有著(zhù)密切的聯(lián)系。胞內細菌能導致自噬增強和炎癥產(chǎn)生，而自噬精準調控病原體引起的炎癥反應，主要有以下3種形式：①自噬通過(guò)清除病原體，進(jìn)而抑制炎癥反應；②自噬可以降解炎癥小體調控炎癥或直接下調炎癥因子；③自噬能夠通過(guò)調控免疫細胞的細胞器功能間接調控炎癥因子產(chǎn)生。因此，自噬對病原體及炎癥的調節起到重要的作用。研究抑制HO-1為靶標的藥物可能對抑制M.abs胞內活性具有潛在的臨床應用價(jià)值。已有文獻報道非編碼單鏈RNA分子模擬物通過(guò)抑制HO-1表達實(shí)現炎癥調節和胞內菌清除。下一步，本研究將通過(guò)數據庫對以HO-1為靶點(diǎn)進(jìn)行microRNA預測并篩選，為將來(lái)靶向藥物的臨床試驗提供科學(xué)依據。

綜上所述，本研究發(fā)現HO-1有效調控M.abs誘導的自噬流發(fā)生，并且HO-1抑制劑SnPP通過(guò)增強細胞自噬活性，有效抑制M.abs胞內存活及炎癥反應。為下階段以抑制HO-1為靶向的免疫治療藥物篩查提供科學(xué)的理論依據。