3、結果和討論

在表征脂肪酶對某些天然脂質(zhì)的底物特異性時(shí)，最常用的方法是基于乳化反應體系，使用pH-stat法。雖然通過(guò)這種方法，我們可以得到酶對某些天然脂質(zhì)底物的酶活性，并且可以滿(mǎn)足酶對界面的需求，但反應對底物和酶的需求是豐富的，當底物或酶價(jià)格昂貴或不易獲得時(shí)，不適合評估酶的活性。這種方法的另一個(gè)限制是，對于乳化體系，不可能控制“界面質(zhì)量”，也不可能在恒定表面壓力下跟蹤脂肪酶的動(dòng)力學(xué)行為[10]。據報道，表面壓力可以通過(guò)橫向密度的變化以及脂質(zhì)組織和結構的變化影響脂質(zhì)結構域的形成，最終影響脂肪酶的立體選擇性、區域選擇性和底物選擇性[17-19]。因此，傳統的pH-stat法對活性檢測仍有一定的局限性。此外，由于不同天然磷脂標準品的價(jià)格非常昂貴，因此沒(méi)有采用常規的活性測試方法。在此，使用小體積的酶和底物進(jìn)行單層技術(shù)，并在反應過(guò)程中精確控制表面壓力，選擇單層技術(shù)來(lái)研究底物特異性。

圖1顯示了空氣-水界面上不同磷脂單層的π-A曲線(xiàn)形狀。這里測試的所有磷脂的π-A曲線(xiàn)的形狀都是在所有顯示的表面壓力下單一液體膨脹（LE）和液體冷凝（LC）狀態(tài)的特征。在壓縮時(shí)，單層經(jīng)歷了一個(gè)轉變，這被視為從LE（低于10 mN/m）到LC狀態(tài)的轉變。在高分子區域，由于分子堆積的增加，表面壓力升高，但不改變單層膜的彈性。最后，單分子膜達到了一種更為濃縮的狀態(tài)，但在π-a等溫線(xiàn)的形狀中沒(méi)有明顯的崩塌點(diǎn)。對于這里測試的磷脂，它們都可以形成穩定的膜，并表現出良好的壓縮性能，DOPC的表面壓力甚至達到57 mN/m。

在本研究中，為了獲得商業(yè)酶對各種天然磷脂的底物選擇性信息，并為實(shí)際應用提供經(jīng)濟指導，商業(yè)酶直接使用，無(wú)需進(jìn)一步加工。此外，子階段使用的緩沖液pH值調整為5.0，與油脫膠工業(yè)中使用的實(shí)際反應條件一致?；谏鲜靓?A曲線(xiàn)，我們最終選擇在10 mN/m到30 mN/m的表面壓差下測試超乳糖酸酶對不同磷脂的活性。

圖2示出了使用各種磷脂作為水解底物獲得的詳細活性-表面壓力曲線(xiàn)?？梢钥闯?，酶的水解活性高度依賴(lài)于表面壓力。然而，每種底物的活性曲線(xiàn)不同。發(fā)現基板PE、PS和CL的鐘形曲線(xiàn)具有特征性的最佳表面壓力值（圖2B、D、E）。在低于15 mN/m的表面壓力下，未檢測到基本酶活性。水解活性隨表面壓力的增加而增加。在25 mN/m的表面壓力下，觀(guān)察到PE、PS和CL的最大活性。然而，當表面壓力高于25 mN/m時(shí)，所有這些磷脂的水解活性降低。與所有測試的底物相比，在25 mN/m的表面壓力下，PE的水解率最高，水解活性達到5272.31×10-11摩爾。cm-2。最小-1。mL-1。對于PI，在15 mN/m以下也沒(méi)有觀(guān)察到水解速率，但是，沒(méi)有觀(guān)察到鐘形曲線(xiàn)，并且隨著(zhù)表面壓力從15 mN/m增加到30 mN/m，活性增強（圖2C）。對于PC，從10 mN/m到25 mN/m觀(guān)察到鐘形曲線(xiàn)，但在30 mN/m的表面壓力下，活性進(jìn)一步增加。隨著(zhù)表面壓力從25 mN/m增加到30 mN/m，表面輪廓上的單層構象可能發(fā)生了變化，導致活性增加。在本實(shí)驗中，在測試的表面壓力范圍內，SM沒(méi)有活性。從π-A曲線(xiàn)可以看出，在25 mN/m的表面壓力下測試的所有磷脂都處于液態(tài)冷凝狀態(tài)，沒(méi)有達到各自的坍塌壓力。在這種情況下，超卵磷脂酶對不同單分子磷脂膜的偏好順序為PE>CL>PS>PI>PC。在這些條件下，SM沒(méi)有活性。Lecitase Ultra選擇性的詳細機制仍需闡明。

4、結論

利用單層技術(shù)，成功地表征了超乳糖酸酶對各種天然磷脂的底物特異性。在本研究中，除SM外，Lecitase Ultra對各種磷脂表現出廣泛的選擇性。在所有測試的磷脂中，觀(guān)察到對兩性磷脂PE的高度偏好。目前對Lecitase Ultra的研究為其底物選擇性提供了第一手信息，并為在原油脫膠或磷脂轉化過(guò)程中有效利用該酶提供了有利信息。

這項工作是由中國國家自然科學(xué)基金（31471690,31401627）、中國廣東省科技計劃（2013B0510000 09）和中國廣州珀爾里弗科技計劃（201610010074）提供的。作者聲明沒(méi)有利益沖突。

人物傳說(shuō)

圖1不同磷脂的表面壓力-面積等溫線(xiàn)。

圖2使用不同磷脂的卵磷脂酶超水解活性隨表面壓力的變化。在室溫下，在零級槽中進(jìn)行分析。緩沖液：50毫米檸檬酸緩沖液（pH值5.0）?；钚员硎緸閱挝粫r(shí)間、單位反應室面積和“零級”槽中每毫升酶水解的底物摩爾數（摩爾數cm-2.min-1.mL-1）。