2結果與分析

2.1生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選

經(jīng)富集分離共得到49株細菌，初步篩選出14株生長(cháng)較好的目的菌株接種于發(fā)酵培養基。在微生物采油過(guò)程中，表面活性劑和有機酸可以把原油從巖層中剝離下來(lái)，提高原油流動(dòng)性。因此，以發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液的pH和表面張力的降低為指標，對初篩得到的菌株進(jìn)行復篩，同時(shí)分析所產(chǎn)生物表面活性劑的類(lèi)型，結果見(jiàn)表1。

表1初篩菌株的發(fā)酵測定結果

由表1可知，菌株29#、30#、31#、37#、47#的發(fā)酵液的表面張力值及pH較低。選取該5株菌進(jìn)行分析，菌株29#、30#、31#發(fā)酵液的表面張力及pH比較接近，產(chǎn)生的生物表面活性劑均為糖脂，在原油平板上的菌落均為熒光綠色，種子液和發(fā)酵液均為熒光綠色，細胞均為桿狀且大小相同。因此，判斷該3株菌為同一菌種。復篩得到的菌株為31#、37#、47#。

2.2生物表面活性劑產(chǎn)生菌的生理生化特性

對篩選所得菌株進(jìn)行常規生理生化特性實(shí)驗，結果如表2所示。根據表2所示結果和《伯杰氏(Berge)菌種鑒定手冊》的描述，可鑒定菌株31#為假單孢屬，菌株37#、47#均為芽孢桿菌屬。

表2生物表面活性劑產(chǎn)生菌的生理生化特性

2.3生物表面活性劑產(chǎn)生菌的生長(cháng)特性

2.3.1菌株31#的生長(cháng)特性

菌株31#的生長(cháng)特性如圖1所示。在發(fā)酵前48 h，菌株31#細胞疏水性呈上升趨勢，菌體密度逐步增長(cháng)，發(fā)酵液的表面張力下降。表明較強的細胞疏水性能增加菌體對疏水性有機物的吸附，從而增加菌體與有機物的接觸機會(huì )，增強對有機物的利用能力，導致菌體大量生長(cháng)并產(chǎn)生大量的生物表面活性物質(zhì)，使發(fā)酵液的表面張力大幅度下降，產(chǎn)生的生物表面活性物質(zhì)通過(guò)改變吸附界面的特性來(lái)調節細胞與界面之間的親和力，進(jìn)一步促進(jìn)微生物細胞對烴類(lèi)化合物的附著(zhù)和烴類(lèi)化合物穿透細胞膜間隙。在發(fā)酵48～84 h期間，菌體生長(cháng)進(jìn)入衰亡期，細胞疏水性下降，發(fā)酵液的表面張力呈下降趨勢，這是部分菌體自溶釋放出細胞內的生物表面活性物質(zhì)的結果。在發(fā)酵84～108 h期間，細胞疏水性呈下降趨勢，發(fā)酵液的表面張力隨菌體密度增大而增大，表明菌體攝取烴類(lèi)化合物能力降低，利用發(fā)酵液中積累的生物表面活性劑呈現二次生長(cháng)。在發(fā)酵108～120 h期間，細胞疏水性上升，表面張力下降。由于31#為革蘭氏陰性菌，細胞外壁中存在與其疏水性密切相關(guān)的脂多糖，發(fā)酵液中大量積累的生物表面活性劑導致細胞壁中脂多糖大量流失，從而引起細胞疏水性增大。

圖1菌株31#的好氧培養過(guò)程曲線(xiàn)

2.3.2菌株37#的生長(cháng)特性

菌株37#的生長(cháng)特性如圖2所示。在發(fā)酵過(guò)程中，細胞疏水性總體呈上升趨勢。發(fā)酵24 h時(shí)，細胞疏水性大于1，菌體密度隨細胞疏水性的增大而增大。發(fā)酵36 h時(shí)，發(fā)酵液的表面張力降低，這是因為烴類(lèi)的難溶性使得微生物在攝取烴類(lèi)生長(cháng)過(guò)程中往往伴隨著(zhù)生物表面活性劑的生成，其主要作用是使烴類(lèi)在水溶液中有效擴散，并滲入細胞內部被同化分解，菌體能夠更好地利用烴類(lèi)碳源生長(cháng)，菌體密度上升。在發(fā)酵48～84 h期間，菌體生長(cháng)進(jìn)入穩定期，菌體密度保持不變。在發(fā)酵84～96 h期間，菌體密度上升，細胞出現二次生長(cháng)。這是由于液體石蠟是一種混合物，菌體首先攝取較易利用的10個(gè)碳以上的長(cháng)鏈烷烴，然后再利用其他鏈長(cháng)的烷烴進(jìn)行生長(cháng)，同時(shí)因為細胞疏水性上升，細胞利用液體石蠟的能力增強，從而產(chǎn)生大量的生物表面活性物質(zhì)，使發(fā)酵液的表面張力下降。在發(fā)酵96～120 h期間，細胞疏水性的降低，菌體密度降低，菌體生長(cháng)進(jìn)入衰亡期，發(fā)酵液的表面張力上升。

圖2菌株37#的好氧培養過(guò)程曲線(xiàn)

2.3.3菌株47#的生長(cháng)特性

菌株47#的生長(cháng)特性如圖3所示。在發(fā)酵前48 h，菌體密度顯著(zhù)增長(cháng)，細胞疏水性增大，發(fā)酵液的表面張力降低。在發(fā)酵60～72 h期間，菌體密度減小，細胞疏水性降低，發(fā)酵液表面張力降低，菌體生長(cháng)進(jìn)入衰亡期。在發(fā)酵72～84 h期間，菌體密度增加，細胞出現二次生長(cháng)，產(chǎn)生大量的生物表面活性物質(zhì)，使發(fā)酵液的表面張力大幅下降。在發(fā)酵84～120 h期間，菌體密度降低，發(fā)酵液的表面張力在保持一段時(shí)間的基本穩定后升高。表明菌體在利用烴類(lèi)生長(cháng)過(guò)程中，產(chǎn)生了生物表面活性劑。生物表面活性劑的產(chǎn)生降低了油水界面張力，使烷烴得以有效擴散，增大油水界面面積，從而便于細胞與較大油滴之間的直接接觸，同時(shí)使細胞的疏水性變大，導致細胞親油，從而有利于菌對烴類(lèi)的利用。

圖3菌株47#的好氧培養過(guò)程曲線(xiàn)

2.4生物表面活性劑的化學(xué)組分分析

將菌株31#、37#和47#于30℃培養后，對發(fā)酵液萃取所得生物表面活性劑粗制品進(jìn)行硅膠薄層層析，結果如圖4所示。將萃取所得生物表面活性劑粗制品進(jìn)行酸解，硅膠薄層層析結果如圖5所示。

圖4的層析結果顯棕色，說(shuō)明菌株31#、37#和47#所產(chǎn)的生物表面活性劑均為糖脂。由圖5可知，菌株31#、37#和47#所產(chǎn)的生物表面活性劑經(jīng)酸解后顯棕色斑點(diǎn)，且Rf值與鼠李糖的Rf值相同，說(shuō)明菌株31#、37#和47#所產(chǎn)的生物表面活性劑的糖基均為鼠李糖。

圖4生物表面活性劑粗品的TLC圖譜

圖5生物表面活性劑酸解后的TLC圖譜

3結論

通過(guò)對發(fā)酵液表面張力及pH的測定，篩選出3株生物表面活性劑產(chǎn)生菌，且所產(chǎn)的生物表面活性劑均為鼠李糖脂；經(jīng)生理生化鑒定，菌株31#為假單胞菌屬，菌株37#、47#為芽孢桿菌屬；通過(guò)對所篩菌株的生長(cháng)特性的研究，說(shuō)明菌體密度、細胞疏水性、發(fā)酵液的pH及表面張力之間密切相關(guān)，相互制約。在以液體石蠟為唯一碳源培養時(shí)，菌株31#的發(fā)酵液表面張力下降最多，且表現出的細胞疏水性最強，發(fā)酵液表面張力下降到49.47 mN/m，細胞疏水性為3.09%。較強的細胞疏水性有利于菌體對疏水性基質(zhì)的利用，從而導致菌體密度的增長(cháng)及發(fā)酵液表面張力的下降，這對微生物開(kāi)采稠油十分有利。

生物表面活性劑產(chǎn)生菌菌體密度、細胞疏水性與發(fā)酵液pH及表面張力的關(guān)系（一）

生物表面活性劑產(chǎn)生菌菌體密度、細胞疏水性與發(fā)酵液pH及表面張力的關(guān)系（二）