2結果與討論

2.1生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選和鑒定

經(jīng)過(guò)血平板初篩得到25株菌株，表1是表面張力儀復篩結果?？梢园l(fā)現147號細菌發(fā)酵液的張力值明顯低于其他菌株，選擇147細菌作為目標菌株。

觀(guān)察菌株培養特征及形態(tài)特征，可見(jiàn)菌體細長(cháng)且長(cháng)短不一，菌落較小，為扁平、濕潤的菌落。部分生理生化指標如表2。經(jīng)16S rDNA測試并與GenBank中已登錄的核苷酸序列號進(jìn)行同源性比較，發(fā)現菌株147與Pseudomonas aeruginosa DSM50071同源性為99%，采用MEGA 5.10軟件NJ方法構建147的16S rDNA系統發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖1。結合生理生化特征結果，將菌株147鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），該菌株GenBank登錄號為KU921686。

表1細菌復篩結果

表2 147菌株的生理生化特性

2.2147細菌產(chǎn)生表面活性劑的物質(zhì)結構鑒定

通過(guò)薄層色譜分析顯示，苯酚-硫酸試劑有棕色斑點(diǎn)，加入茚三酮顯色劑則無(wú)明顯變化。這說(shuō)明該菌株主要產(chǎn)糖脂類(lèi)生物表面活性劑，不產(chǎn)生或者產(chǎn)生少量的脂肽類(lèi)物質(zhì)。

將菌株147產(chǎn)物提純，紅外光譜儀（FT-IR）分析物質(zhì)結構，結果如圖2。該物質(zhì)在3701.72cm-1處有吸收峰，表明分子中有羥基存在；2 858.77～2 927.56 cm-1處的吸收峰表明存在糖類(lèi)C-H的伸縮振動(dòng)，1400～1200 cm-1處是C-H變角振動(dòng)，1 734.39 cm-1處是C=O的雙鍵振動(dòng)，而1 070.04 cm-1處為C-O-C鍵伸縮振動(dòng)，因此該物質(zhì)中有一個(gè)五元環(huán)狀內酯和糖苷鍵存在。由此進(jìn)一步證明該生物表面活性劑含糖脂類(lèi)物質(zhì)。

發(fā)酵產(chǎn)物臨界膠束濃度是指分子在溶劑中締合形成膠束的最低濃度。臨界膠束濃度（Critical micelle0.005 concentration，CMC）可以作為表面活性劑表面活性的一種度量，CMC越小，改變表/界面性質(zhì)，起到增溶、乳化等所需的濃度就越低。從圖3可以看出：糖脂在0～300 mg·L-1時(shí)，表面張力值隨著(zhù)糖脂濃度的升高而降低，且在300 mg·L-1時(shí)達到最小值；在300～500 mg·L-1時(shí)，表面張力值變化不大?？傻冒l(fā)酵粗提產(chǎn)物的CMC為300 mg·L-1，明顯低于普通化學(xué)表面活性劑十二烷基磺酸鈉（SDS）的2200 mg·L-1，能在較低濃度下使用，因而在醫藥、食品、化工等行業(yè)具有廣闊應用前景。

圖1 147菌株16S rDNA基因序列系統發(fā)育樹(shù)

圖2 147菌株產(chǎn)的生物表面活性劑紅外光譜圖

圖3不同濃度生物表面活性劑溶液的表面張力

2.3147細菌發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1碳源的影響

碳源對細菌的生長(cháng)與發(fā)酵產(chǎn)物量有重要影響。銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）可在多種類(lèi)型碳源下產(chǎn)生生物表面活性劑，包括甘油、乙醇、植物油等。由表3可知，以花生油為碳源，細菌發(fā)酵液的降低值為39.12 mN·m-1，明顯高于其他碳源類(lèi)型；乳化值為34.17%，稍高于其他碳源，此時(shí)細菌生物量最大，糖脂含量最高，為0.30 g·L-1。雖然花生油作為碳源，能夠促進(jìn)菌株產(chǎn)生更多生物表面活性劑，但如果用于實(shí)際生產(chǎn)，成本相對較高，近年來(lái)一些研究者嘗試使用成本較低的工業(yè)副產(chǎn)物如糖蜜、廢潤滑油等作為碳源，發(fā)現也具有很好的促進(jìn)微生物產(chǎn)生生物表面活性劑的作用。因此，后期會(huì )考慮選擇用一些低成本碳源進(jìn)行發(fā)酵。

2.3.2氮源的影響

細胞表面的物質(zhì)合成需要氮源，氮源的種類(lèi)會(huì )對細菌細胞的生長(cháng)和發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量產(chǎn)生很大影響。由表4可以看出，不同氮源對細菌發(fā)酵過(guò)程中表面張力降低值的影響較小，可能與發(fā)酵液中的生物表面活性劑含量已經(jīng)達臨界膠束濃度（CMC）有關(guān)。當氮源為硫酸銨時(shí)發(fā)酵液表面張力降低值最大，同時(shí)乳化性、細菌干重、糖脂含量均達到最大值。這與錢(qián)曉勇等研究結果一致，硫酸銨是促進(jìn)生物表面活性劑生成的較好氮源。

表3碳源對147細菌生長(cháng)以及生物表面活性劑產(chǎn)量的影響

表4氮源對147細菌生長(cháng)以及生物表面活性劑產(chǎn)量的影響

2.3.3碳氮比的影響

由表5可以發(fā)現當碳氮比在5以上時(shí)，表面張力降低值與乳化性變化不大，而細菌干重與生物表面活性劑含量卻明顯不同，說(shuō)明當碳氮比大于5時(shí)，該菌株生物表面活性劑產(chǎn)量已經(jīng)超過(guò)臨界膠束濃度。細菌干重在碳氮比為25時(shí)最大，為2.58±0.09 g·L-1，同時(shí)生物表面活性劑含量也達到最大，為1.74±0.01 g·L-1。這與Saimmai等研究結果一致，25是147菌株的最適生長(cháng)碳氮比，此時(shí)細菌的生物量達到最高，生物表面活性劑產(chǎn)量也最高。