2結果與分析

2.1β-乳球蛋白納米纖維形成動(dòng)力學(xué)

圖1加熱不同時(shí)間的β-乳球蛋白納米纖維的ThT熒光強度

ThT熒光染色法是檢測蛋白質(zhì)纖維化的典型方法。ThT通過(guò)與蛋白質(zhì)纖維中β-折疊結構的特異性結合而具有特定的熒光行為。該方法可以檢測β-折疊結構的變化從而獲得纖維化程度的信息，即形成的蛋白質(zhì)纖維的數量。ThT熒光強度越強，意味著(zhù)形成的蛋白質(zhì)纖維越多。從圖1可以看出，熒光強度隨著(zhù)加熱時(shí)間延長(cháng)逐漸增加。在熱處理的前4 h內熒光強度的增加較為緩慢，隨后則快速增加。大約10 h后，曲線(xiàn)出現平臺區，熒光強度值保持相對穩定，意味著(zhù)蛋白質(zhì)纖維化轉變已經(jīng)完成。本實(shí)驗觀(guān)察到的現象與其他蛋白質(zhì)相關(guān)現象類(lèi)似。

2.2β-乳球蛋白纖維聚集體形成過(guò)程中的形貌變化

如圖2所示，在開(kāi)始階段（圖2A），β-乳球蛋白呈現出均勻球狀，粒徑約為30～40 nm，分散良好。加熱0.5 h后（圖2B）可觀(guān)察到球狀蛋白粒徑開(kāi)始減小，而分布更加密集，可能由于蛋白質(zhì)的水解導致。直到加熱2 h后（圖2D），開(kāi)始出現明顯的蛋白質(zhì)納米纖維，但纖維數量較少。進(jìn)一步加熱會(huì )導致纖維數量增加，直徑變粗（圖2E、F）。Mezzenga等研究了纖維的形成機理及過(guò)程，發(fā)現蛋白質(zhì)分子在反應初始階段發(fā)生水解，然后部分以β-折疊結構為主的片段在靜電排斥力和疏水相互作用的平衡下進(jìn)行有序聚集，即自組裝作用，形成纖維狀聚集物。一旦纖維開(kāi)始形成，其生長(cháng)的進(jìn)程快且雙向進(jìn)行，最后形成具有長(cháng)直結構的蛋白質(zhì)纖維。從圖2可以得出，在蛋白質(zhì)纖維化轉變的不同階段，其產(chǎn)物的組成、形貌是不同的，意味著(zhù)其界面性質(zhì)的差異。

圖2加熱不同時(shí)間形成的β-乳球蛋白納米纖維的透射電子顯微鏡圖

2.3纖維化過(guò)程中β-乳球蛋白界面性質(zhì)的變化

圖3纖維化過(guò)程中β-乳球蛋白在油水界面的吸附動(dòng)力學(xué)過(guò)程（A）及其飽和界面張力（B）的變化

乳液的形成及穩定性決定于界面物質(zhì)的吸附行為和界面膜的黏彈模量。采用懸滴法對β-乳球蛋白纖維化轉變過(guò)程中不同階段產(chǎn)物的界面吸附動(dòng)力學(xué)過(guò)程和界面膜的黏彈模量進(jìn)行研究。圖3A為各階段產(chǎn)物在油-水界面的界面張力隨時(shí)間的變化?？梢杂^(guān)察到，所有樣品的界面張力隨吸附時(shí)間逐漸上升，意味著(zhù)不同階段產(chǎn)物均具有界面吸附行為。一段時(shí)間后界面張力上升速度趨于平緩，表明物質(zhì)在界面上的吸附逐漸達到飽和。從圖3B可以發(fā)現，纖維化轉變不同階段的產(chǎn)物，其平衡界面張力存在區別。在開(kāi)始階段，飽和界面張力隨蛋白加熱時(shí)間的延長(cháng)而升高，當加熱時(shí)間超過(guò)2 h后，飽和界面張力的變化不再明顯。綜合上述分析可以看出，在熱處理的初始階段，蛋白質(zhì)發(fā)生了水解，這一現象使得蛋白質(zhì)分子質(zhì)量變小，而擴散速度增加，因而相對未水解的蛋白能達到更高的飽和界面張力。盡管過(guò)度水解會(huì )導致蛋白質(zhì)界面活性的破壞，但后期隨著(zhù)納米纖維的形成，混合體系的整體界面活性仍然能保持較高水平。

圖4纖維化過(guò)程中β-乳球蛋白在油/水界面的擴張流變學(xué)特性

如圖4A所示，隨著(zhù)蛋白不斷吸附到油-水界面上（界面張力的增加），樣品的黏彈模量也不斷增加，說(shuō)明不同纖維化階段的產(chǎn)物在油/水界面存在明顯相互作用，使得界面層具有較強的黏彈性。同時(shí)隨著(zhù)纖維化轉變的進(jìn)行（加熱時(shí)間的延長(cháng)），其界面黏彈模量逐漸升高，說(shuō)明纖維化轉變有利于界面吸附層的黏彈性的提高。如圖4B所示，隨著(zhù)纖維化轉變的進(jìn)行，其飽和模量不斷升高，但在不同階段，其變化幅度不同。即在纖維化的初始階段上升較快，而后期則上升不明顯，這表示纖維化轉變的完成，體系中纖維的數量增加不再明顯，體系的界面黏彈模量的變化趨于平緩。蛋白質(zhì)納米纖維屬于形狀各向異性材料，其在油/水界面上的相互作用不同于一般的球形顆?；蛉嵝愿叻肿?，具有更強的相互作用，因而能產(chǎn)生更高的界面黏彈性。食品油/水界面或氣/水界面的穩定依賴(lài)于界面膜的強度，即黏彈模量。目前食品行業(yè)大多數采用的吐溫、蔗糖酯等小分子表面活性劑所形成的界面膜通常較弱，在食品儲藏過(guò)程中容易使界面失穩，從而導致食品結構的破壞（如奶油的乳析、植脂末的滲油等）。蛋白質(zhì)纖維聚集體所表現出的高界面強度則有助于上述問(wèn)題的解決。

2.4纖維化過(guò)程對β-乳球蛋白乳化性的影響

圖5纖維化轉變過(guò)程中β-乳球蛋白納米纖維穩定的乳液外觀(guān)（A）、平均粒徑（B）和常溫貯藏時(shí)粒徑（C）的變化

從圖5A可以看出，纖維化的各個(gè)階段的產(chǎn)物均能形成較為穩定的油/水乳液，并且隨著(zhù)纖維化程度提高，乳液中乳化層的厚度增加，意味著(zhù)纖維化產(chǎn)物的乳化能力的提高。通過(guò)乳液的平均粒徑（圖5B）可以看出，乳液的粒徑隨著(zhù)纖維化程度的提高而逐漸減小，直至纖維化轉變2 h后，其產(chǎn)物形成的乳液粒徑趨于穩定，說(shuō)明其乳化能力的變化不再明顯，與圖5A圖現象一致。如圖5C所示，隨著(zhù)儲藏時(shí)間的延長(cháng)，乳液的粒徑均有所上升，這是由于乳液在儲藏過(guò)程中乳滴之間發(fā)生了一定程度的絮凝或聚集。絮凝主要由于乳滴之間的靜電排斥力所致，而聚集則由于乳滴表面的界面強度不足所致。比較不同樣品在30 d儲藏過(guò)程中的粒徑變化發(fā)現，未轉化的蛋白乳液平均粒徑增加了1.907μm，而纖維化0.5～12 h的蛋白，其乳液的平均粒徑分別增加了0.63μm（0.5 h），1.08μm（1 h），1.09μm（2 h），3.00μm（5 h），2.80μm（7 h）和3.20μm（12 h）。由此可見(jiàn)，纖維化0.5 h的乳液相對最為穩定，未經(jīng)纖維化轉變或過(guò)長(cháng)時(shí)間的纖維化轉變均不利于乳液的穩定性。纖維化轉變后，柔性蛋白分子轉變?yōu)榫哂幸欢▌傂缘睦w維聚集體，該聚集體相對于蛋白分子具有更高的界面吸附能，從而提高了乳液的穩定性。而長(cháng)時(shí)間的纖維化所導致的乳液穩定性下降，可能由于連續相中的纖維產(chǎn)生的耗散性絮凝所導致。在實(shí)際應用中，乳化能力和乳化穩定性需要同時(shí)考慮。較高的乳化能力有助于形成粒徑較小的乳滴，而乳化穩定性有助于乳液保持長(cháng)期的穩定性。綜合比較，纖維化2 h的蛋白質(zhì)較適宜于在食品乳化中的應用。

3結論

本實(shí)驗對β-乳球蛋白在纖維化轉變不同階段的產(chǎn)物進(jìn)行了表征，并對其界面及乳化行為進(jìn)行了分析研究。在纖維化轉變初期，蛋白質(zhì)發(fā)生水解，2 h后開(kāi)始形成少量纖維。隨時(shí)間延長(cháng)纖維數量則開(kāi)始增加，直徑變粗。通過(guò)對界面吸附行為和界面流變性分析可知，β-乳球蛋白的纖維化轉變可有效提高其界面活性，且增強了界面上蛋白分子間的相互作用。通過(guò)乳化實(shí)驗，發(fā)現隨著(zhù)纖維化轉變過(guò)程的延長(cháng)，其產(chǎn)物的乳化能力逐漸提高，但乳化穩定性在開(kāi)始階段有所提高，后期逐漸下降。綜合比較，纖維化2 h的產(chǎn)物最適宜用于食品的乳化。