小腸（hSI）是人類(lèi)重要的器官，執行著(zhù)包括消化在內的眾多功能，包括但不限于初始和選擇性屏障活動(dòng)、營(yíng)養吸收、宿主-微生物相互作用，以及宿主防御和免疫反應的調節?？诜o藥是最常見(jiàn)的給藥方式，許多藥物在小腸中被吸收并開(kāi)始代謝。過(guò)去十年，研究者嘗試總結體內腸道復雜生理功能的各個(gè)方面，并利用人類(lèi)結腸腺癌細胞系（Caco-2）以及人工膜系統，來(lái)建立評估藥物在小腸中的吸收和代謝的實(shí)驗模型。然而，現有的模型無(wú)法充分模擬hSI的功能，也無(wú)法反映藥物轉運體、藥物代謝酶和緊密連接的表達模式所扮演的重要作用。此外，這些模型中缺乏細胞色素P450酶(CYP3A4)，而hSI中最豐富的藥物代謝酶正是P450，這導致了Caco-2模型不適合研究腸道首過(guò)效應和生物利用度。近年來(lái)，原代人腸上皮細胞（hIEC）模型的發(fā)展取得了顯著(zhù)進(jìn)展，例如3D人體腸道類(lèi)器官（hIOs）。但由于人體腸道類(lèi)器官內缺乏增殖細胞群，難以將腸上皮細胞培養成融合的單分子層，因此從人體腸道類(lèi)器官生成單層hSI模型十分困難。

鑒于此，韓國生命工學(xué)研究院的一項研究開(kāi)發(fā)了一種重復性良好的兩步方法來(lái)誘導人多能干細胞分化為可擴大的hIEC祖細胞和具有功能性的hIEC單層細胞。

為了從人多功能干細胞（hPSCs）中獲得單層hSI模型，研究者建立了一種新的定向分化方案，來(lái)模擬體內腸道發(fā)育過(guò)程。該方案采用激活素A（Activin A）、表皮生長(cháng)因子（EGF）、Wnt信號通路激動(dòng)劑R-spondin 1和胰島素等來(lái)誘導hPSCs向hIEC祖細胞分化，并進(jìn)一步分化為有功能性的hIEC。經(jīng)過(guò)長(cháng)時(shí)間傳代后（大于10代，培養大于5個(gè)月），腸細胞標記物和緊密連接分子的表達沒(méi)有明顯變化，腸上皮功能相關(guān)實(shí)驗同樣使用Transwell系統。

圖1｜由hPSCs分化hIECs的過(guò)程與相關(guān)表征

由于在hSI中，Wnt的抑制和Notch的激活有助于祖細胞分化為吸收前上皮細胞，研究者使用了Wnt信號抑制劑Wnt-c59和Notch信號激動(dòng)劑丙戊酸(VPA)，來(lái)進(jìn)一步將hIEC祖細胞分化為與體內類(lèi)似的成熟且有功能的hIEC。與其他僅由吸收性腸細胞組成的小腸上皮模型相比，該系統可以模擬體內樣腸組織進(jìn)行研究。與未成熟的hIECs相比，功能性hIECs形成了一個(gè)結構極化的單層，并觀(guān)察到了類(lèi)似杯狀細胞分泌出的粘液。此外，功能性單分子層hIEC的頂表面接觸的細菌數量明顯更高，并且黏液蛋白和黏液蛋白相關(guān)基因的表達在功能性hIEC中顯著(zhù)增加能夠允許腸道微生物群的持續定植。

圖2｜功能性hIECs單層模型的結構與功能表征

隨后，研究分析了各種腸道轉運體和代謝酶的表達水平，通過(guò)RNA測序與酶活性檢測，發(fā)現腸道堿性磷酸酶（IAP）和CYP3A4在功能性hIEC中表達量相當高，這些結果表明功能性hIEC具有藥物轉運體和藥物代謝酶活性，是評價(jià)藥物體外生物利用度所必需的。本研究使用了6種臨床藥物：美托洛爾、普萘洛爾、雙氯芬酸、雷尼替丁、呋塞米和紅霉素，進(jìn)行體外藥物吸收試驗，發(fā)現與Caco-2模型不理想的體內外相關(guān)性相比，功能性hIEC與已公布的人體內腸道吸收數據擬合的相關(guān)性良好，說(shuō)明功能性hIEC可以更好地預測人的口服生物利用度和吸收程度。

圖3｜6種臨床模型藥物在功能性hIECs與Caco-2模型上吸收的擬合結果

總而言之，此研究發(fā)明了一套可靠且完善的hIECs培養系統，可以用來(lái)產(chǎn)生具有接近體內功能的小腸上皮單層，以取代目前的體外模型，提供一個(gè)新的通用的藥物體外腸吸收的檢測平臺。