1.3實(shí)驗方法

1.3.1 LOPs的制備

新鮮牡蠣開(kāi)殼后取出全肉，牡蠣肉與水按照料液比為1∶3(g:mL)進(jìn)行勻漿處理，8 000 r/min勻漿2 min，按3 300 U/g加入動(dòng)物蛋白酶，47℃下酶解3 h，酶解后于95℃滅酶10 min，于4 500 r/min離心20 min，收集上清液。用超濾膜過(guò)濾上清液，將濾液濃縮處理后進(jìn)行噴霧干燥，即可獲得LOPs。

1.3.2 LOPs界面性質(zhì)檢測

1.3.2.1 LOPs濕潤性測定

采用全自動(dòng)界面黏彈性測量?jì)x測定LOPs的三相接觸角θ，將LOPs薄片(厚度為1 mm、直徑為10 mm)置于載物臺后(環(huán)境為氣相)，向下緩慢移動(dòng)針管(懸掛8μL的液滴)使得液滴(液相)轉移至薄片(固相)，利用系統攝像機拍攝記錄圖像。在每個(gè)片劑表面的不同位置進(jìn)行測量，測量結果取平均值。

1.3.2.2 LOPs水溶液界面張力測定

池內，形成18μL的LOPs液滴浸沒(méi)于大豆油中，懸掛時(shí)間為600 s。在室溫(25℃)下，使用儀器自帶軟件分析液滴輪廓，并監測液滴形狀的動(dòng)態(tài)變化，根據楊氏方程(Laplace-Young)擬合結果計算液滴的界面張力。

1.3.3 LOPs雙重乳液制備及體外模擬消化吸收特性測定

1.3.3.1 LOPs的W1/O/W2型雙重乳液制備

通過(guò)兩步法制備雙重乳液，制備流程及分子模型見(jiàn)圖1。操作步驟:將內、外水相及油相攪拌15 min，混勻后于4℃避光貯藏12 h備用;第一步，將質(zhì)量分數為20%的LOPs水溶液作內水相，內水相與油相的質(zhì)量比為4∶6。將內水相加入含有PGPR(質(zhì)量分數為5%)的大豆油中，先經(jīng)高速剪切機(12 000 r/min，2 min)混合后，再經(jīng)高壓均質(zhì)機在70 MPa條件下循環(huán)3次，獲得W1/O初乳液。第二步，將質(zhì)量分數為0.8%的吐溫80水溶液作外水相，W1/O乳液與外水相的質(zhì)量比為5∶5。將W1/O乳液加入外水相后，再用高速剪切機(4 000 r/min，1 min)混合，并經(jīng)高壓均質(zhì)機在30 MPa的條件下均質(zhì)1次，獲得LOPs的W1/O/W2型雙重乳液，于4℃條件下存儲。

圖1 LOPs雙重乳液制備流程及其分子模型

1.3.3.2體外模擬消化液的配制與消化實(shí)驗

模擬消化液是由相應的電解質(zhì)溶液、酶、CaCl2和膽酸鹽組成。按表1配制各階段的模擬消化液，其中，采用NaOH、HCl調節模擬消化液的pH值(模擬唾液的pH值為7、模擬胃液的pH值為3和模擬腸液的pH值為7)，CaCl2(H2O)2可在酸環(huán)境下形成CaCl2。將模擬消化液與新鮮乳液、上一階段消化后的乳液以體積比1∶1混合，于37℃，120 r/min的條件下進(jìn)行模擬消化，模擬口腔消化時(shí)長(cháng)5 min，模擬胃消化和腸道消化時(shí)長(cháng)均為2 h。取各階段消化產(chǎn)物與新鮮未消化乳液用于分析測定，比較模擬消化前后乳液的粒徑、包封率與顯微結構的變化情況。

表1模擬消化液的配制

括號中帶*數字為最終消化混合物中相應的Ca2+濃度。

1.3.3.3粒徑測定

采用馬爾文納米粒度儀，室溫條件下測定乳液粒徑，于折射率為1.33，光散射角度為173°條件下，測定乳液的平均粒徑、多分散指數(polydispersity index，PDI)和粒徑分布。

1.3.3.4光學(xué)顯微鏡觀(guān)察

取樣品約5μL滴加于載玻片上，使用光學(xué)顯微鏡于100倍油鏡物鏡視野下進(jìn)行觀(guān)察，利用系統攝像機記錄微觀(guān)形態(tài)照片。

1.3.3.5包封率測定

取6 g待測樣品與去離子水以質(zhì)量比1∶1稀釋?zhuān)p輕手搖混勻，然后在3 000 r/min、4℃條件下離心10 min。利用注射器針頭收集每個(gè)離心樣品的水層(乳液的下層)，并使用0.22μm注射器式過(guò)濾器過(guò)濾油滴后取得濾液。采用BCA蛋白質(zhì)試劑盒制作LOPs的標準曲線(xiàn)，測定濾液中LOPs的含量，標準曲線(xiàn)方程為:y=0.014 2x+0.166 2(R2=0.979)。包封率(EE)計算公式見(jiàn)式(1)。

(1)

式(1)中，EE為包封率，%;m0為L(cháng)OPs加入內水相的質(zhì)量，g;m為從外水相中獲得的游離LOPs的質(zhì)量，g。

1.3.4 LOPs及其雙重乳液的體外模擬吸收與轉運實(shí)驗

1.3.4.1 LOPs及其雙重乳液對Caco-2細胞的毒性實(shí)驗

選取生長(cháng)對數期的Caco-2細胞，將其接種在96孔酶標板(1×105個(gè)/孔)并置于培養箱培養(含體積分數為5%的CO2、溫度設為37℃)約24 h后，加入100μL不同濃度(基礎培養基稀釋)的LOPs水溶液及其雙重乳液(稀釋前沸水浴加熱30 min滅菌，乳液未破乳)，每個(gè)濃度設置6個(gè)平行，于含有體積分數為5%的CO2、溫度為37℃的培養箱中培養24 h后，向每孔加入體積為20μL的MTT溶液(5 mg/mL)和80μL基礎培養基，繼續溫育4 h后，除去孔內培養液并向每孔加入150μL的DMSO，將培養板置于搖床上低速振蕩10 min。用酶標儀測定酶標板各孔在490 nm的吸光度。實(shí)驗中同時(shí)設立正常細胞對照孔(無(wú)樣品，有Caco-2細胞、培養液、MTT和DMSO)以及空白對照孔(無(wú)樣品，無(wú)Caco-2細胞，有培養基、MTT和DMSO)。根據測定的吸光度計算Caco-2細胞的存活率，計算方法見(jiàn)式(2)。

式(2)中，A為樣品吸光度，A0為空白對照組吸光度，A1為正常細胞培養的對照組吸光度。

1.3.4.2 Caco-2單層細胞模型的建立與驗證

構建3個(gè)初始細胞密度分別3×105、5×105、10×105個(gè)/mL的Caco-2單層細胞模型，用Transwell培養皿接種Caco-2細胞，細胞接種模型見(jiàn)圖2。細胞生長(cháng)狀態(tài)維持21 d左右，前7 d每?jì)商旄鼡Q膜兩側培養基，后14 d每天定時(shí)更換膜兩側培養基，直到Caco-2細胞完全融合形成完整的單層。通過(guò)測定跨膜電阻、堿性磷酸酶(AKP)活性和熒光素鈉通量比較和驗證單層Caco-2細胞模型的完整性、分化狀況和致密性。

圖2 Caco-2細胞接種的Transwell培養皿模型

1)跨膜電阻的測定。采用電阻儀測定并記錄細胞膜兩側的跨膜電阻(trans-epithelial electrical resis-tance，TEER)，根據式(3)計算TEER。

TEER=(R-R0)×S。(3)

式(3)中，TEER為跨膜電阻，Ω·cm2;R為頂膜側(AP)的電阻，Ω;R0為基底膜側(BL)的電阻，Ω;S為膜面積(1.12 cm2)。

2)AKP活性測定。采用AKP試劑盒分別測定AP側、BL側的堿性磷酸酶活性，酶活性單位為金氏單位/100 mL(一個(gè)金氏單位=7.14 U/L)，并計算膜兩側的酶活力比值(AP/BL)。

3)熒光素鈉通量測定。制作490 nm處熒光素鈉的標準吸收曲線(xiàn);采用培養21 d后的Transwell培養皿，于A(yíng)P側加入0.5 mL、20μg/mL熒光素鈉溶液(D-hanks平衡液溶解)，BL側加入1.5 mL的D-hanks平衡液，每間隔30 min測定BL側在490 nm處的吸收度，并補充BL側平衡液體積至1.5 mL，共計培養2 h。根據式(4)計算熒光素鈉透過(guò)率。

式(4)中，mBL側為BL側的熒光素鈉質(zhì)量，μg;mAP側初始為10μg。

1.3.4.3 Caco-2單層細胞轉運實(shí)驗

根據1.3.3.2中的實(shí)驗結果，選取合格的細胞模型，測定LOPs溶液、LOPs雙重乳液(依據毒性實(shí)驗結果選取)在膜兩側的表觀(guān)滲透系數和流出比(表觀(guān)滲透系數比值)，探究?jì)烧叩倪\輸方式。運輸實(shí)驗在兩個(gè)方向上進(jìn)行。AP側→BL側:AP側加入0.5 mL樣品液，BL側加入1.5 mL D-hanks的平衡液。BL側→AP側:在BL側加入1.5 mL樣品液，AP側加入0.5 mL D-hanks平衡液。分別孵育150 min后收集BL側、AP側溶液待測。采用BCA蛋白測定法測定待測液中LOPs含量。根據樣品在兩個(gè)方向上的檢測結果計算表觀(guān)滲透系數Papp(AP-BL)、Papp(BL-AP)及兩個(gè)方向上的表觀(guān)滲透系數比值Papp(BL-AP)/Papp(AP-BL)，計算方法見(jiàn)式(5)。

式(5)中，Q為AP側或BL側檢測到的轉運量;t為實(shí)驗轉運時(shí)間(150 min);S為膜面積(1.12 cm2);c0為BL側或AP側樣品的初始濃度。

1.4數據處理

實(shí)驗數據以平均值±標準差表示，用OrginPro2024軟件繪圖。用SPSS 26.0軟件采用方差分析進(jìn)行差異顯著(zhù)性分析，P<0.05表示差異顯著(zhù)。