3. 結果和討論

3.1. 表面壓力和表面電位面積等溫線(xiàn)。 表面壓力和表面電位 ? HI-Langmuir單層的面積等溫線(xiàn)如圖1所示。 表面壓力和表面電勢的提升對應于750和900?2分子 ? 分別為1。 與表面壓力相比，人們期望在更大的表面電勢區域觀(guān)察到升力。 這是由于表面偶極子的長(cháng)程相互作用，而范德華相互作用主要由表面壓力測量。 關(guān)于極限分子面積，即表面壓力線(xiàn)性部分的外推 ? 零表面壓力的面積等溫線(xiàn)，值為620?2分子 ? 獲得1。 該區域對應于空氣中HI蛋白的最緊密狀態(tài) ? 水界面，該值與先前發(fā)表的關(guān)于牛胰島素Langmuir單層的研究一致。3,17

圖1。 表面壓力( △) 表面電位 ? 區域( ○) 亞相pH值5.6時(shí)人胰島素Langmuir單層的等溫線(xiàn)。

將分子面積從750減小，可以觀(guān)察到表面壓力下的氣-液膨脹相變 ? 面積等溫線(xiàn)。從585進(jìn)一步降低到350表明朗繆爾單層的液體冷凝相。一個(gè)達到坍塌表面壓力25.2mN m ? 1.坍塌前的表面壓力測量顯示π線(xiàn)性增加 ? 等溫線(xiàn)。穩定性測量的下一節將顯示HI-Langmuir單層在二維中是穩定的。

圖2.三個(gè)壓縮 ? 在亞相pH值5.6下，減壓循環(huán)達到10（a）和30 mN/m（B）的人胰島素Langmuir單層表面壓力。

3.2.壓縮 ? 人胰島素Langmuir單層的減壓周期和穩定性等溫線(xiàn)。圖2A和B顯示了壓縮 ? 在兩個(gè)目標表面壓力（即10和30 mN m）下測得的減壓循環(huán)等溫線(xiàn) ? 1.選擇這兩種表面壓力的基本原理是觀(guān)察液體冷凝膜中膜在坍塌表面壓力前后的穩定性。壓縮后 ? 從0到10和30 mN m的減壓循環(huán) ? 1，我們觀(guān)察到初始壓縮和最后減壓（第三個(gè)循環(huán)）之間的變化分別小于5%和10%。這一結果表明HI蛋白仍保留在界面上。必須指出的是，高達10 mN m的循環(huán) ? 1顯示了等溫線(xiàn)的重疊，這支持了胰島素蛋白可能在液體膨脹和濃縮階段保持其構象的解釋。關(guān)于HI-Langmuir單層的穩定性（圖3），觀(guān)察到當單層在10和30 mN m保持恒定時(shí)，面積隨時(shí)間減少 ? 1在6500年代期間。測量到10和30 mN m的下降15%和60% ? 1。崩塌后，崩塌表面壓力預計會(huì )大幅降低。通過(guò)BAM研究HI聚集的可能性，并將HI與FITC結合，稍后將討論。

圖3.在亞相pH值5.6下，在表面壓力為10（A）和30 mN/m（B）的條件下，對人胰島素Langmuir單層膜進(jìn)行90 min的穩定性測量。

3.3.紫外線(xiàn) ? 人胰島素在水相和Langmuir單層膜中的可見(jiàn)光譜和熒光光譜研究了HI在水溶液（pH 2）中的光物理性質(zhì) 和作為L(cháng)angmuir單層，分別如圖4和圖5所示。圖4包括溶液中人胰島素的吸收光譜和發(fā)射光譜。水HI（pH 2）的發(fā)射峰 當在270 nm處激發(fā)時(shí)，在305 nm處觀(guān)察到。該峰對應于HI中存在的四種酪氨酸氨基酸。該值與在pH值為7（即303）的其他工作中獲得的值相當 ? 然而，在空氣中為305 nm.21 ? 水界面，在270 nm激發(fā)時(shí)未觀(guān)察到熒光（圖5B）。觀(guān)察到的唯一峰是294 nm處的拉曼峰。這可以解釋為HI濃度低（0.3 mg/mL） 這是生成表面壓力等溫線(xiàn)所必需的。因此，由于HI作為L(cháng)angmuir單層沒(méi)有熒光，因此無(wú)法在作為L(cháng)angmuir單層的HI和溶液中的熒光光譜之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)或比較。

圖4.紫外線(xiàn) ? vis（5×10 ? 5米）和熒光（5×10 ? 7 M；λ激發(fā)=270 nm，激發(fā)和發(fā)射處的狹縫寬度，分別為5和5 nm）人胰島素水溶液的光譜。

通常蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸在260左右出現峰值 ? 280 nm，220附近有一個(gè)峰，這是由于肽鍵引起的。 圖5A所示的光譜在紫外光譜中呈現出276 nm處的峰值 ? 由于蛋白質(zhì)中存在酪氨酸而產(chǎn)生的可見(jiàn)光譜。 除了276nm處的峰外，由于肽鍵的作用，蛋白質(zhì)預計在190nm處有一個(gè)強峰，在210和220nm之間有一個(gè)弱峰。 在溶液中，觀(guān)察到的人胰島素的唯一峰值為276nm。 溶液中不同濃度的人胰島素產(chǎn)生的光譜寬肩接近200 ? 220 nm，表明肽鍵引起的峰重疊。 圖5A顯示了人胰島素Langmuir單層的吸光度光譜。 在空中 ? 在水界面，在224和276nm處觀(guān)察到兩個(gè)不同的峰，代表人胰島素中存在的肽鍵和酪氨酸。 當這兩個(gè)峰值與增加的表面壓力對應時(shí)，它們呈線(xiàn)性關(guān)系。 空氣中吸光度的線(xiàn)性 ? 水界面表明HI單層在崩塌點(diǎn)之前的穩定性。

圖5.（A） 紫外線(xiàn) ? 亞相pH值為5.6時(shí)人胰島素Langmuir的可見(jiàn)光譜。 插圖顯示了224和276 nm處吸光度隨表面壓力的變化。 （B） 亞相pH 5.6下人胰島素朗繆爾的熒光光譜（λ激發(fā)=270 nm，激發(fā)和發(fā)射時(shí)的狹縫寬度分別為5和5 nm）。

下一節將研究HI-Langmuir單層在二維域中潛在形成的地形。該觀(guān)察使用了兩種方法，即熒光法和布魯斯特角顯微鏡。22,23

3.4. 人胰島素朗繆爾單層的表觀(guān)熒光和布魯斯特角顯微鏡觀(guān)察。 人胰島素Langmuir單層的形貌通過(guò)FITC人胰島素的表觀(guān)熒光進(jìn)行檢查，而布魯斯特角顯微鏡用于2-D純人胰島素。由于胰島素是非熒光的，因此必須附加熒光團才能使用表觀(guān)熒光顯微鏡。 蛋白質(zhì)常用的探針是異硫氰酸熒光素（FITC）。

已知FITC胰島素的比例（1:1），計算分子量，以制備在空氣中攤鋪的適當濃度的水溶液 ? 水界面。 在5、10、20和30 mN m的表面壓力下獲得了表面熒光顯微照片 ? 1，如表1所示。 在所有表面壓力下均觀(guān)察到均勻的HI-Langmuir單層，圖像中未顯示μm范圍內的疇的形成。 為了驗證這一觀(guān)察結果，采用布魯斯特角顯微鏡（BAM）在與表觀(guān)熒光顯微鏡相同的壓力下對薄膜的形貌進(jìn)行成像。 BAM數據證實(shí)了表觀(guān)熒光測量結果。 為了確保BAM系統正常工作，對花生酸Langmuir單層進(jìn)行了檢查。 觀(guān)察到的地形證實(shí)了已經(jīng)公布的結果（表1）

表1。 通過(guò)（A）HI-FITC-Langmuir單層樣品的表觀(guān)熒光測量了四種表面壓力； （B） BAM用于胰島素HI-Langmuir單層； （C） 花生酸Langmuir單層BAM（胰島素濃度：0.30 mg/mL）

3.5. 胰島素的二級結構。 為了研究胰島素分子在2-D中相互作用的性質(zhì)，通過(guò)紅外光譜檢查HI水相和Langmuir單層。 研究了HI水相的FTIR和圓二色譜（CD），而HI-Langmuir單層膜采用紅外反射吸收光譜（IRRAS）。

圖6。 （A） 在pH 2和溫度20±1°C條件下，水性胰島素的圓二色光譜和（B）FTIR光譜。胰島素濃度分別為0.3和2 mg-mL ? 分別為1。

如圖6A所示，與β-片相比，CD光譜包含高比例的α-螺旋。 它表明水相中存在單體且不存在聚集體。24圖6B顯示了水相HI的FTIR光譜，主峰位于1650、1542、1440和1373 cm處 ? 1. 1650和1542厘米處的峰值 ? 1對應于α-螺旋的酰胺I和酰胺II區域。25 ? 27 CD和FTIR光譜證實(shí)水性HI以α-螺旋存在，因此在水相中以單體形式存在。

圖7。 在亞相pH 5.6條件下，使用60°入射角和改變表面壓力，對人胰島素Langmuir單層膜進(jìn)行p極化輻照。

IRRAS是研究Langmuir單分子膜在空氣中取向和構象變化的重要技術(shù) ? 水界面。 IRRAS測量值作為反射率獲得 ? 吸光度（RA）與波數。 RA定義為 ? log10（R/RF），其中R是薄膜覆蓋表面的反射率，RF是水的反射率。28 ? 30當振動(dòng)與空氣平行時(shí) ? 水界面，對于平行于入射面的p極化輻射，譜帶最初為負值，其強度隨著(zhù)入射角的增加而增加，直到布魯斯特角（2920 cm為54.5°） ? 30通過(guò)在不同表面壓力下使用IRRAS，我們研究了HI-Langmuir單層膜的取向和構象的變化（圖7、8和9）。 IRRAS用于分析蛋白質(zhì)的結構特征，例如通過(guò)1700區域的酰胺I和酰胺II帶解釋的α-螺旋和β-折疊 ? 1600和1600 ? 1500厘米 ? 分別為1.19,20

圖8。 在亞相pH值5.6和表面壓力10 mN/m以及改變入射角的條件下，人胰島素Langmuir單層膜的p極化輻照。

給出了三種IRRAS光譜。 圖7顯示了不同表面壓力下60°的極化，圖8顯示了10 mN/m的恒定表面壓力和30到70°范圍內的變化角度，圖9顯示了25°恒定角度和變化表面壓力下的s極化。 表2給出了α-螺旋和β-片的譜帶特征以及對應于α-螺旋的酰胺I和酰胺II振動(dòng)。

圖7顯示了HI-Langmuir單層在不同表面壓力下60°時(shí)的p極化。 這條帶子在1517厘米處 ? 1對應于α-螺旋。 在1 mN/m的表面壓力下，有兩個(gè)可見(jiàn)帶：1652和1637 cm ? 1. 隨著(zhù)表面壓力的增加，這兩個(gè)譜帶重疊并成為一個(gè)寬帶。 在30百萬(wàn)米 ? 1，波段可視為單個(gè)波段，頻率為1648厘米 ? 1. 這是對應于α-螺旋的酰胺II區域的條帶。 下一個(gè)波段在1531厘米處以1 mN/m的寬帶出現 ? 1. 隨著(zhù)表面壓力的增加，它分成三個(gè)帶：1550、1536和1522厘米 ? 1. 在1550和1522厘米處的頻帶 ? 1分別對應于α-螺旋和β-折疊中的酰胺II區域。 這種譜帶分裂表明，譜帶位于1531厘米處 ? 在較低的表面壓力下，1由α-螺旋和β-片組成。 在較高的表面壓力下，譜帶分離為離散的單個(gè)峰。 光譜中出現的其他峰是由于氨基酸和烷烴鏈的存在。 這條帶子長(cháng)1448厘米 ? 1對應于C ? H CH2和CH3的剪切。 HI-Langmuir單分子膜的p-極化輻照度中存在所有三個(gè)表明α-螺旋的主譜帶。

圖9。 亞相pH為5.6，入射角為25°，且改變表面壓力時(shí)，人胰島素Langmuir單層的s極化輻照。

圖8顯示了HI-Langmuir單層在10 mN m處的p極化 ? 1在30、35、40、60、65和70°的六個(gè)不同角度。 在布儒斯特角之前，30、35和40 mN/m處的角未顯示出β片的特征帶。 所有三個(gè)角度顯示1655和1540厘米處的條紋 ? 1分別對應于酰胺I和酰胺II吸收。 這條帶子在1517厘米處 ? 1，對應于α-螺旋，在35°和40°中存在。 在布儒斯特角之后，所有60、65和70°的三個(gè)角都顯示出介于1650和1655之間的帶，這對應于α-螺旋中的酰胺I吸收。 當角度為60°時(shí)，在1523 cm處可以看到峰值 ? 1，對應于β片。 光譜中的其他譜帶都不是α-螺旋或β-片的特征。 光譜表明HI在空氣中以α-螺旋的形式存在 ? 水界面。 在10 mN m的恒定壓力下，隨著(zhù)角度的增加 ? 1，發(fā)現光譜中的α-螺旋特征減少。

圖9顯示了在不同表面壓力下獲得的HI-Langmuir單層膜的s偏振輻照度。 在1 mN m的表面壓力下 ? 1，在1650 cm處存在一條帶 ? 1對應于α-螺旋。 隨著(zhù)表面壓力的增加，該條帶消失，并在1666 cm處并入該條帶 ? 1. 這條帶子長(cháng)1666厘米 ? 1包括β-轉角和α-螺旋。 這條帶子有1694厘米長(cháng) ? 1對應于β片。 這條帶子在1519厘米處 ? 1也對應于α-螺旋。 在入射角為60°的情況下，在1670處觀(guān)察到的能帶可歸屬于存在于β-轉角中的空間約束C=O部分，或者由于β-薄片中的躍遷偶極耦合而注意到峰值中的分裂。 當改變表面壓力時(shí)，最強烈的譜帶出現在1554和1539厘米處 ? 1，兩條帶均對應于酰胺II區的α-螺旋。 所有三條主譜帶都表明HI-Langmuir單層的s極化輻照度中存在α-螺旋。

表2。 α螺旋和β片的主帶位置特征及酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ的紅外振動(dòng)

從上述CD、FTIR和IRRAS數據可以得出結論，溶解在pH 2中的HI在溶液和空氣中以螺旋構象存在 ?

人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表面化學(xué)和光譜學(xué)性質(zhì)——摘要、介紹

人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表面化學(xué)和光譜學(xué)性質(zhì)——實(shí)驗部分

人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表面化學(xué)和光譜學(xué)性質(zhì)——結果和討論

人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表面化學(xué)和光譜學(xué)性質(zhì)——結論、致謝！