3.結果和討論

通過(guò)CD光譜（圓二色光譜和支持信息中的圖S3）和表面壓力測量（圖S4）對HSA-TR和野生型HSA進(jìn)行比較表明，染料標記僅輕微干擾HSA的二級結構和疏水性。通過(guò)Langmuir-Schaefer技術(shù)和AFM，我們證明了在A(yíng)WI處形成的蛋白質(zhì)膜可轉移到云母表面，并且類(lèi)似于一層蛋白質(zhì)層厚(～3 nm）用于HSA-TR和HSA（圖S5）。這與先前的中子反射率研究（建議為單層）非常一致。16因此，最小標記、接近天然的HSA為通過(guò)熒光顯微鏡研究AWI組裝提供了有用的模型蛋白質(zhì)樣品。

在圖1中，HSA-TR溶解在PBS中（離子強度=193 mM），并在前面所述的小室裝置中成像（圖1A）。當HSA-TR（[HSATR]）的濃度大于或等于0.050 mg/mL時(shí)，通過(guò)共聚焦顯微鏡觀(guān)察到均勻的熒光層，如圖1B所示。光學(xué)分辨率為～0.2μm，4倍變焦圖像（圖1C）顯示界面層沒(méi)有特殊結構。然而，當[HSA-TR]小于或等于0.025 mg/mL時(shí)，在界面處觀(guān)察到高度不均勻結構，如圖1D所示。放大圖像（圖1E）顯示HSA-TR組裝成微米大小的分形結構。XZ平面圖像進(jìn)一步證實(shí)了不同的結構，圖1F中觀(guān)察到厚度均勻的熒光層，而圖1G中觀(guān)察到不連續的熒光層。我們的結果表明，在PBS中離子強度為193mm的條件下，表面飽和體積溶液濃度（CB sat）在0.025和0.050 mg/mL之間。在CB sat以下，吸附的蛋白質(zhì)不能完全覆蓋AWI，因此允許在界面處形成蛋白質(zhì)結構域。以前使用張力測定法和橢偏法的報告發(fā)現，覆蓋AWI的BSA臨界濃度在10-2和10-1 mg/mL之間，13這與我們的結果非常吻合。

盡管蛋白質(zhì)吸附領(lǐng)域的研究人員普遍接受CB sat的概念，13,34但很少有研究揭示了濃度低于WCB sat的組裝蛋白質(zhì)的微觀(guān)結構。Powers等人報告了在A(yíng)WI上觀(guān)察到由兩親性肽形成的相結構域。23 Lee等人最近利用微流變學(xué)進(jìn)行的一項研究表明，在相對較低的濃度下，AWI的β-乳球蛋白層中存在機械不均一性。在我們之前的研究中，在用俄勒岡州綠標記的人纖維蛋白原的AWI處也觀(guān)察到不連續的熒光層，如果蛋白質(zhì)在類(lèi)似的緩沖條件下以0.01 mg/mL溶解。30早期基于2D晶格的模擬預測，在低濃度下，可通過(guò)擴散限制聚集形成分形網(wǎng)絡(luò )。36 AWI處的XY平面圖像（圖1E）證實(shí)了在低亞相濃度下AWI處存在分形組裝和AWI處的異質(zhì)蛋白質(zhì)層。

然后，我們改變溶液的離子強度和氧化還原狀態(tài)，并監測AWI形成的蛋白質(zhì)組裝體。在將溶液移液到腔室后，在成像之前將界面老化1小時(shí)。PBS中0.010 mg/mL HSA-TR（離子強度=53 mM）的樣品在界面不同位置顯示出分形組裝（圖2A）和相互連接的“瑞士干酪”結構（圖2B）。XY平面圖像的Z疊層顯示了相同條件下界面蛋白質(zhì)層的高分辨率3D圖像（圖2C）。3D圖像是尺寸為45.0*45.0μm2的多個(gè)XY平面圖像的疊加，這些圖像沿AWI上方和下方的Z軸采集，每個(gè)方向10μm（200*0.1μm步長(cháng)）。這證實(shí)了界面處的“瑞士奶酪”結構，并且幾乎沒(méi)有顯示來(lái)自亞相的熒光信號。雖然沿Z軸的光學(xué)分辨率是～2μm對于共焦圖像，其比估計的蛋白質(zhì)層厚度（30-40?）大得多，Z-stack圖像清楚地表明蛋白質(zhì)結構域僅在A(yíng)WI處形成，并且與在XY平面形成的結構域（數百微米）相比，Z方向上的組裝受到限制。

圖2。蛋白質(zhì)組裝的形態(tài)，隨離子強度和還原劑的添加而變化。HSATR（0.01 mg/mL）在（A，B）PBS中的AWI下自組裝，pH值7.2，離子強度=53 mM和（C）在掃描體積為45.0*45.0*20.0μm3的情況下，呈現了與圖像B相同的溶液條件對應的共焦圖像Z疊層。（D）PBS，pH值7.2，離子強度=530 mM。（E）30 mM DTT，pH 7.2，離子強度=53 mM的PBS。比例尺：20μm。

在保持蛋白質(zhì)濃度不變的情況下，我們將緩沖液的離子強度增加到530mm。老化1小時(shí)后，我們觀(guān)察到均勻熒光層（圖2D），表明表面過(guò)剩增加，平衡時(shí)間縮短。在緩沖液中含有30mmDTT（圖2E）的樣品中，觀(guān)察到小的分形結構，表明吸附蛋白質(zhì)之間的相互作用較弱。我們還研究了HSA-TR在高離子強度（530mm）的PBS中溶解時(shí)界面層形成的動(dòng)力學(xué)。觀(guān)察到從密集分形（圖3A）到瑞士奶酪結構（圖3B）以及最終到均勻熒光層（圖3C）的明顯轉變。在大約30分鐘內，AWI達到平衡，形成均勻的熒光層。Dhar等人最近的一項研究發(fā)現，隨著(zhù)時(shí)間的推移，BSA層的表面粘度急劇增加，并推斷出組織結構發(fā)生了變化。37我們的研究直接顯示了從分形到均勻組織層的形態(tài)轉變，這可以解釋觀(guān)察到的抗剪切性增加。

圖3。顯示異質(zhì)結構域轉變?yōu)橥|(zhì)層的熒光圖像。C（HSA-TR）=PBS中的0.01 mg/mL，pH值7.2，離子強度=530 mM。（A）3、（B）8和（C）將蛋白質(zhì)溶液引入試驗箱后36分鐘。標尺：50μm。

我們的結果表明，溶液條件可以調節蛋白質(zhì)自組裝的結構。HSA的等電點(diǎn)約為4.7。24因此，在pH值為7.2時(shí)，HSA-TR帶負電。靜電排斥強烈影響HSA-TR在A(yíng)WI處的聚集，導致低包裝效率，如圖2A，B所示。分形結構和瑞士干酪結構共存表明非平衡狀態(tài)，這是由于蛋白質(zhì)從亞相的緩慢吸附受到界面上已經(jīng)存在的帶電蛋白質(zhì)的排斥力的阻礙。在較高的離子強度下，帶電蛋白質(zhì)分子之間的靜電斥力被更有效地屏蔽，HSA-TR吸附到界面的速度更快，并且能夠更緊密地堆積，從而形成更均勻的層。如圖2D和3C所示，AWI的完全覆蓋率低于CB sat。在較低的離子強度（193 mM）下，在吸附時(shí)間1 h后，測定CB sat在0.025和0.050 mg/mL之間的值。在較高的離子強度（530mm）下，由于被吸附的蛋白質(zhì)和來(lái)自塊體的蛋白質(zhì)之間的排斥作用較小，因此塊體溶液蛋白質(zhì)對AWI的吸附更快。此外，蛋白質(zhì)分子在界面上的堆積效率更高，從而實(shí)現了更高的蛋白質(zhì)覆蓋率。

據報道，吸附在A(yíng)WI上的蛋白質(zhì)可以形成分子間二硫鍵，從而穩定蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò )并增強吸附層的彈性。38 HSA有一個(gè)反應性半胱氨酸，Cys34，可在A(yíng)WI處與相鄰蛋白質(zhì)形成二硫鍵。此外，吸附后構象的變化可能導致分子內二硫鍵的斷裂，為分子間二硫鍵的形成提供更多的反應位點(diǎn)。DTT等還原劑抑制分子間二硫鍵的形成，因此只剩下小聚集體，這些聚集體可能通過(guò)疏水相互作用結合在一起。Vogler等人應用界面流變學(xué)來(lái)研究AWI處的HSA，并發(fā)現吸附層既具有粘性又具有彈性。28二硫鍵的形成支持彈性來(lái)自分子間相互作用網(wǎng)絡(luò )的假設。有趣的是，利用BSA進(jìn)行的微流變學(xué)研究發(fā)現，蛋白質(zhì)膜主要是粘性的，沒(méi)有形成強的分子間鍵。37因此，AWI處蛋白質(zhì)二硫鍵的作用可能在不同的蛋白質(zhì)系統中有很大差異。

最后，將FDA批準的表面活性劑F-127添加到HSA-TR溶液中，以改變AWI處吸附物種之間的疏水相互作用。疏水相互作用導致蛋白質(zhì)中疏水單元的組裝或聚集，從而降低溶劑化能。39在蛋白質(zhì)組裝中，多個(gè)蛋白質(zhì)分子的疏水斑塊傾向于聚集在一起，將水從其表面排除，從而增加系統的熵。40當添加更疏水的表面活性劑時(shí)，它與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)疏水相互作用競爭。已知表面活性劑在A(yíng)WI處與蛋白質(zhì)相互作用，顯著(zhù)降低表面張力并改變表面層的流變行為。41如Morris等人先前AFM研究中的“造山”模型所述，表面活性劑以非均勻方式從AWI置換蛋白質(zhì)。19然而，只有BAM研究18提供了現場(chǎng)測量的直接證據，動(dòng)態(tài)轉變的各個(gè)方面仍然未得到充分探索。

通過(guò)我們的原位熒光顯微鏡方法，我們在HSA-TR/F-127混合物的AWI處發(fā)現了熒光強度較強和較弱的區域，表明發(fā)生了相分離。蛋白質(zhì)在A(yíng)WI處形成粘彈性網(wǎng)絡(luò )，導致蛋白質(zhì)的分子遷移率比蛋白質(zhì)-表面活性劑混合物的分子遷移率小2個(gè)數量級。41因此，我們預計富含蛋白質(zhì)區域的熒光恢復速度應比表面活性區域慢得多。為了驗證這一假設，我們進(jìn)行了FRAP實(shí)驗，用HSA-TR/F-127溶液（HSA-TR為0.10 mg/mL）和F-127溶液（HSA-TR為0.0050 mg/mL）評估界面層的流動(dòng)性。用近紫外激光束同時(shí)漂白強熒光和弱熒光區域的兩個(gè)圓形區域20 s。在之前和之后拍攝圖像使用衰減的543nm激光作為激發(fā)源進(jìn)行漂白。照射90秒后，左上方的漂白區變小，25分鐘后，強度幾乎完全恢復；然而，右下方的漂白區域并未隨時(shí)間改變形狀或強度（圖4）。因此，我們得出結論，強度恢復率的巨大差異表明界面上“富含蛋白質(zhì)”和“富含表面活性劑”區域的分離。熒光強度較強的區域主要由HSA-TR組成，熒光強度較弱的區域主要由HSA-TR與F-127混合組成。表面活性劑富集區的蛋白質(zhì)被表面活性劑分子分離，更容易擴散，使得HSA-TR的橫向遷移率遠高于蛋白質(zhì)富集區。然而，熒光恢復期間漂白區形狀的變化表明，富含表面活性劑的區域中的質(zhì)量傳輸不均勻。結合多種擴散過(guò)程的適當分析方法，FRAP實(shí)驗有可能確定AWI處蛋白質(zhì)分子擴散系數的分布。

圖4。界面層光漂白后的熒光恢復。ROI（黃色圓圈）是選定的光漂白區域。ROI-1位于富含表面活性劑的區域，而ROI-2位于富含HSA TR的區域。初始亞相濃度為[HSA-TR]=0.10 mg/mL和[F-127]=0.0050 mg/mL。比例尺：20μm。

我們發(fā)現在HSA-TR/F-127混合物中，蛋白里奇區表現出隨時(shí)間變化的形態(tài)變化，這促使我們更詳細地研究這一動(dòng)態(tài)現象。圖5所示的結果是通過(guò)將HSA-TR（0.50 mg/mL）與F-127（0.015 mg/mL）混合，聚焦在A(yíng)WI上拍攝的圖像。圖5A顯示了將溶液用移液管移入腔室后35至60分鐘內聚焦在同一區域的三幅圖像?？梢?jiàn)面積為10-100μm2的小圓形蛋白質(zhì)島。感興趣區域（ROI，由圖5中的黃色方框表示）突出顯示了一些有趣的觀(guān)察結果：在ROI-1中，與35分鐘時(shí)的圖像相比，小的蛋白質(zhì)島在50分鐘時(shí)與周?chē)牡鞍踪|(zhì)島結合形成一個(gè)更大的島。在ROI-2中，從50分鐘開(kāi)始可以看到小黑洞，表明F-127在這些位點(diǎn)取代了HSA-TR，并在富含蛋白質(zhì)的區域內形成空腔。在ROI-3中，可以觀(guān)察到表面活性劑富集區前沿的移動(dòng)。很明顯，隨著(zhù)時(shí)間的推移，表面活性劑富集區不斷擴大。在ROI-4中，小的蛋白質(zhì)島合并成網(wǎng)狀網(wǎng)絡(luò )。

圖5。蛋白質(zhì)島隨時(shí)間的聚合。（A）導入后35、50和60分鐘拍攝的共焦熒光圖像。比例尺：20μm.（B）蛋白質(zhì)島大小分布的直方圖。初始亞期濃度為[HSA-TR]=0.50 mg/mL和[F-127]=0.015 mg/mL。ROI-1表示一個(gè)區域（黃色框），其中小的蛋白質(zhì)島與周?chē)牡鞍踪|(zhì)島結合形成一個(gè)較大的島；ROI-2表明該區域形成了小黑洞；ROI-3表示在表面活性劑富集區域的邊界處的運動(dòng)；ROI-4顯示了小的蛋白質(zhì)島合并成網(wǎng)狀網(wǎng)絡(luò )的地方。

我們使用ImageJ分析了蛋白質(zhì)島的大小分布（圖5B）。31面積分數定義為相同大小的蛋白質(zhì)島的表面積除以蛋白質(zhì)島總面積的總和。圖5B顯示了島嶼規模分布的明顯增長(cháng)趨勢。蛋白質(zhì)島的平均面積從24μm2（35分鐘）增加到57μm2（60分鐘）。通過(guò)使用30幀/秒的更快掃描速率（支持信息中的電影S1，其中電影中的圖像顯示速度比實(shí)時(shí)慢10倍）也觀(guān)察到蛋白質(zhì)島的運動(dòng)，并且觀(guān)察到蛋白質(zhì)島表現出類(lèi)似于單層脂質(zhì)結構域布朗運動(dòng)的運動(dòng)。42重要的是，觀(guān)察到鄰近島嶼在接觸時(shí)結合在一起。富含蛋白質(zhì)的結構域的存在表明蛋白質(zhì)和表面活性劑在動(dòng)力學(xué)過(guò)程中共同吸附到界面。蛋白質(zhì)分子之間的強相互作用促進(jìn)了結構域的形成和結構域的合并，從而阻止了表面活性劑的置換。然而，F-127的界面占有率在熱力學(xué)上是有利的，其中F-127在0.015 mg/mL時(shí)的平衡表面張力約為40 mN/m43，而HSA在0.50 mg/mL時(shí)的平衡表面張力為52-60 mN/m。34因此，隨著(zhù)時(shí)間的推移，蛋白質(zhì)結構域逐漸被表面活性劑從本體中置換，以降低表面能。

表面活性劑穿透蛋白質(zhì)結構域的觀(guān)察和表面活性劑富集區的擴展符合造山模型。該模型表明，表面活性劑首先穿透蛋白質(zhì)層，形成缺陷或孔洞，從而取代界面上的蛋白質(zhì)。然后，隨著(zhù)表面活性劑繼續在這些區域累積，表面活性劑區域擴張，蛋白質(zhì)層被迫彎曲并延伸到亞相，直到蛋白質(zhì)層最終坍塌。1,19在肺表面活性物質(zhì)/聚乙二醇/白蛋白混合物中顯示了不同的置換機制，這表明競爭吸附過(guò)程可能依賴(lài)于系統。在表面張力和表面流變學(xué)研究中，44個(gè)理論模型已被開(kāi)發(fā)用于解釋蛋白質(zhì)/表面活性劑混合溶液的吸附動(dòng)力學(xué)和平衡狀態(tài)。41作為對這些研究的補充，我們的工作提供了關(guān)于蛋白質(zhì)和表面活性劑在界面上的位置以及組裝結構的更詳細信息。在我們的研究中觀(guān)察到的聚結現象表明，相鄰的蛋白質(zhì)結構域有重組連接網(wǎng)絡(luò )的趨勢，而其他蛋白質(zhì)正被表面活性劑取代，因此突出了HSA-TR/F-127混合物中蛋白質(zhì)結構域聚結和表面活性劑取代蛋白質(zhì)的兩個(gè)競爭過(guò)程。

應用熒光顯微鏡研究了蛋白質(zhì)在氣-水界面的組裝——摘要、介紹

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