摘要

空氣-水界面（AWI）上的蛋白質(zhì)組裝在許多生物過(guò)程中自然發(fā)生，并提供了一種制造生物材料的方法。然而，在A(yíng)WI中控制蛋白質(zhì)自組裝的因素以及吸附過(guò)程中發(fā)生的動(dòng)力學(xué)過(guò)程仍然沒(méi)有得到充分的探索。利用熒光顯微鏡，我們研究了在A(yíng)WI處組裝的一種模型蛋白，即用德克薩斯紅色熒光團最低限度標記的人血清白蛋白。在低亞相濃度下獲得靜態(tài)和動(dòng)態(tài)信息。通過(guò)改變溶液蛋白質(zhì)濃度、離子強度和氧化還原狀態(tài)，我們相應地改變了AWI處蛋白質(zhì)組裝的微觀(guān)結構。pluronic表面活性劑的加入導致AWI發(fā)生相分離，通過(guò)光漂白實(shí)驗后的熒光恢復顯示出流體表面活性劑結構域和更堅硬的蛋白質(zhì)結構域。在這一競爭吸附過(guò)程中，觀(guān)察到蛋白質(zhì)結構域聚結。

1.介紹

眾所周知，蛋白質(zhì)在空氣-水界面（AWI）的行為在食品科學(xué)中對于增強泡沫穩定性和蛋白質(zhì)結晶以指導有序組裝具有重要意義。1,2它在許多生物技術(shù)應用中也具有相關(guān)性，例如，蛋白質(zhì)溶液在平面上的行為以及在流體設備中的行為，其中蛋白質(zhì)吸附在固體水和空氣-水界面上都非常重要。3在醫學(xué)上，肺表面活性物質(zhì)和血清蛋白在肺泡水襯里層上的競爭性吸附因其在急性呼吸窘迫綜合征中的作用而被廣泛研究。4,5在氣體栓塞中也很重要，在血液中，氣泡可以將蛋白質(zhì)吸收到其表面，并導致流向受影響區域的血流和氧氣輸送減少（即栓塞）以及凝血。6對這些過(guò)程的干預或操縱需要對蛋白質(zhì)在A(yíng)WI形成的組裝有更深入的了解。

從另一個(gè)角度來(lái)看，AWI是一種獨特的工具，用于將蛋白質(zhì)作為小的構建單元引導到更大的自組裝結構中。蛋白質(zhì)是天然存在的生物聚合物，具有非對稱(chēng)分布的掩埋和溶劑暴露的活性位點(diǎn)、靜電電荷和疏水/親水殘基。這些特征，再加上幾何約束，決定了折疊蛋白質(zhì)及其較大組裝體的結構。組裝復雜的生物或合成系統的一種策略是促進(jìn)一個(gè)或兩個(gè)維度的相互作用。液體界面在這方面特別有用，因為其中存在各向異性力和二維空間限制。7-9除了液體界面的特殊特性外，通?？刂谱越M裝的因素是構建塊的化學(xué)和結構互補性。10對于蛋白質(zhì)等大分子，其活性部位、幾何結構以及靜電和疏水相互作用受到周?chē)軇┓肿雍推渌苜|(zhì)的極大影響。11,12因此，溶液條件為在A(yíng)WI處控制蛋白質(zhì)組裝提供了方便的手柄。

先前的張力測定法、反射測定法和橢偏測定法研究了AWI中蛋白質(zhì)的表面過(guò)剩變化和結構構象與溶液條件（如亞相濃度、pH值和離子強度）的關(guān)系。13-16這些技術(shù)在宏觀(guān)尺度上提供了吸附蛋白質(zhì)的整體平均特性。為了在納米到微米尺度上研究AWI的組裝結構，已經(jīng)應用了原子力顯微鏡（AFM）、布魯斯特角顯微鏡（BAM）和熒光顯微鏡等成像技術(shù)。17-19 AFM提供納米空間分辨率，但涉及將界面膜轉移到固體表面，這導致結構保真度和時(shí)間分辨率的損失。17 BAM與Langmuir槽耦合是一種廣泛使用的原位方法，但其空間分辨率（2μm）低于許多衍射受限光學(xué)成像技術(shù)，且動(dòng)力學(xué)信息很少。18,20 Fujita等人對AWI的疏水螺旋肽組裝21和Gluck等人對多糖吸附22的開(kāi)創(chuàng )性研究表明，熒光顯微鏡有可能作為研究AWI大分子自組裝的簡(jiǎn)易原位成像工具。通過(guò)這種技術(shù)，Powers等人發(fā)現了在A(yíng)WI上自組裝的兩親性肽的中等依賴(lài)性微米級相域。23在這項具有里程碑意義的研究中所做的觀(guān)察尚未推廣到蛋白質(zhì)系統。在這里，我們首次證明了通過(guò)系統地改變溶液條件來(lái)控制AWI蛋白質(zhì)自組裝微觀(guān)結構的能力。

本研究以得克薩斯紅標記的人血清白蛋白（HSA-TR）為模型蛋白，在不同溶液條件下用原位熒光顯微鏡研究了其自組裝的微觀(guān)結構。人血清白蛋白（HSA）提供了一個(gè)有用的模型蛋白質(zhì)系統，因為它的生物物理性質(zhì)已經(jīng)在溶液中和AWI中得到了很好的研究。16,24其相關(guān)性來(lái)自于一個(gè)事實(shí)，即HSA是人體血漿中最豐富的蛋白質(zhì)（3.5-5.0 g/dL），用于維持血漿脹亡壓和轉運配體。當氣體栓塞進(jìn)入血管時(shí)，血漿蛋白（如HSA）在氣體-血液界面吸附和聚集。25這些界面蛋白層被懷疑會(huì )影響氣泡與內皮表面的粘附，并通過(guò)與內皮或血小板表面上的大分子相互作用引發(fā)血液凝結。26

HSA由一條含有585個(gè)氨基酸的多肽鏈組成，其中包括35個(gè)半胱氨酸和59個(gè)賴(lài)氨酸。三十四個(gè)半胱氨酸形成17個(gè)分子內二硫鍵，單一的反應性Cys34對氧化還原狀態(tài)極為敏感。24,27 X射線(xiàn)結晶學(xué)證實(shí)HSA具有α-螺旋二級結構，并在生理條件下鑒定出一個(gè)心形或等邊三角形三級結構，一側80?，厚度30?。24反射計研究還發(fā)現界面處的血清白蛋白層厚度為30-40?，但蛋白質(zhì)被近似為一個(gè)橢球體，長(cháng)軸平行于界面140?，垂直短軸為40?。16光譜和流變學(xué)方法先前已在A(yíng)WI處發(fā)現單層HSA粘彈性膜，蛋白質(zhì)保留其二級結構。16,28,29

目前的研究應用原位熒光顯微鏡在一個(gè)小型成像室中研究AWI處的蛋白質(zhì)組裝～10μL溶液，同時(shí)限制液-固界面上的競爭性蛋白質(zhì)吸附。形成了一個(gè)穩定的界面，蒸發(fā)量可以忽略不計，這使得在亞微米的空間分辨率和毫秒到小時(shí)的時(shí)間尺度上可以獲得AWI處蛋白質(zhì)行為的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)信息。我們的結果揭示了在A(yíng)WI形成的微尺度蛋白質(zhì)組裝，并強調了溶液條件在控制組裝結構中的作用。還觀(guān)察到AWI處的相分離動(dòng)力學(xué)轉變。

應用熒光顯微鏡研究了蛋白質(zhì)在氣-水界面的組裝——摘要、介紹

應用熒光顯微鏡研究了蛋白質(zhì)在氣-水界面的組裝——材料和方法

應用熒光顯微鏡研究了蛋白質(zhì)在氣-水界面的組裝——結果和討論

應用熒光顯微鏡研究了蛋白質(zhì)在氣-水界面的組裝——結論、致謝！